MiR-200a在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義

徐韶華,程文俊,許培箴

(1.南京醫科大學附屬常州市婦幼保健院婦瘤科,江蘇常州,213003;2.南京醫科大學第一附屬醫院婦科,江蘇南京,210029)

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,死亡率居女性惡性腫瘤之首,5年生存率不超過40%,70%的卵巢癌發現已屬晚期[1]。因此,探索卵巢癌發生發展的分子機制及尋找早期診斷的指標一直是卵巢腫瘤研究的熱點。越來越多的研究表明,miRNA在許多惡性腫瘤中存在異常表達,其通過調控靶基因而影響腫瘤的發生、發展、侵襲轉移,發揮類似癌基因或抑癌基因的作用[2]。miRNA在卵巢癌中的異常表達也被越來越多的研究證實,主要集中在miRNA-200家族中。但是miR-200a在卵巢上皮癌中的表達,不同研究組的結果并不一致。為此,本研究采用Taqman探針實時熒光定量PCR方法檢測上皮性卵巢癌組織中miR-200a的表達,分析miR-200a與臨床病理特征之間的關系,探討miR-200a在卵巢癌發生發展中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象

組織標本來自2008年1月～2011年1月在南京醫科大學第一附屬醫院婦科和南京醫科大學附屬常州市婦幼保健院婦瘤科行手術治療的上皮性卵巢癌患者40例,術前均未接受放療、化療,術后均經病理確診。患者年齡28～72歲,平均53歲。按國際婦產科聯盟(FIGO)的分期標準,Ⅰ期6例、Ⅱ期 10例、Ⅲ期 22例、Ⅳ期2例。病理分級:G1 10例、G2 13例、G3 17例。另取同期年齡匹配的良性上皮性卵巢腫瘤組織30例做對照。所有標本離體后10min內置于液氮內保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取:采用T RIzol法提取組織總RNA,方法按照說明書進行。RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法進行質量控制并進行濃度測定。D260/D280比值在1.7-2.0者用于后續實驗檢測。

1.2.3 反轉錄:用Taqman miRNA反轉錄試劑盒和miRNA特異性莖環結構(stem-loop)反轉錄引物進行miRNA反轉錄反應,操作參照ABI公司實驗流程進行,進行部分調整。總反應體系為 15 μ L 。 包括 3 μ L 5 ×反 轉錄引物 、0.15 μ L 100 mmol/L dNTP和dT TP混合物、1 μ L反轉錄酶(50 U/μ L)、1.5 μ L 10 ×反轉錄緩沖液 、0.19 μ L RNA 抑制劑,共5.84 μ L。將上述體系輕柔混勻,輕微離心。每個反應體系中加入 9.16 μ L RNA,吹打混勻,輕微離心。將混合好的體系在下列條件下進行反轉錄反應:16℃孵育2 min,42℃反應1 min,50℃反應1 s,上述3步經40個循環反應,再85℃孵育5 min。

1.2.3 實時定量RT-PCR檢測miR-200a的表達:miRNA每個反應體系為5 μ L,其中包括1 μ L稀釋后的 cDNA、0.25 μ L 20×miRNA 檢測探針 、2.5 μ L 2 ×基因表達 Master Mix、1.25 μ L 雙蒸水。每個miRNA檢測配置3平行所需的體系,輕柔混勻,使用ABI Prism7900熒光定量PCR儀,PCR的反應條件:95℃5 min※95℃15 s,60℃1 min進行45個循環。原始數據用SDS 2.3軟件進行初步分析。

以U6作為相對定量的內參,2-△CT為目的基因的相對表達量[△CT=CTmiR-200a-CT U6]。所有樣本均重復3孔。

2 結 果

2.1 上皮性卵巢癌、良性上皮性卵巢腫瘤組織中miR-200a的相對表達量

miR-200a在上皮性卵巢癌組織中的相對表達量為0.0355(0.0043,0.3700),在良性上皮性卵巢腫瘤中的相對表達量為0.0017(0.0004,0.0047)。采用非參數秩和檢驗,兩者之間差異具有顯著性(P<0.01)。

2.2 miR-200a的相對表達量與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征的關系

miR-200a在早期卵巢癌組織(FIGOⅠ+Ⅱ)中的表達量0.1517(0.0047,0.6436)明顯高于晚期卵巢癌組織(FIGO Ⅲ+Ⅳ)中表達量0.0207(0.0031,0.0939),差異具有統計學意義(P<0.05);在低分化卵巢癌組織中表達量為0.0386(0.0038,0.1257),明顯低于高中分化卵巢癌組織中表達量0.1325(0.0045,0.5892),但差異不具顯著性(P=0.1377);不同腫瘤類型、有無淋巴結轉移的卵巢癌組織中表達量的比較,差異均無統計學意義。

3 討 論

MicroRNA是一類大小為20-25核苷酸的非編碼小RNA,其通過與靶mRNA 3′UTR區相結合導致靶基因的降解或翻譯受抑制,從而調控基因的表達。最近研究表明,miRNAs與人類多種腫瘤的發生密切相關,已知50%的miRNAs基因位于腫瘤相關的基因組區域或者位于脆性位點,促進了腫瘤的發生和進展,其作用類似于癌基因或抑癌基因[3]。

miR-200a屬于miRNA-200家族,其編碼基因定位于染色體1p35.33。通過其5′末端種子序列AACACU與靶基因mRNA的3′端非編碼區(3′UTR)部分堿基完全或不完全互補配對,負性調控基因表達。miR-200a在許多惡性腫瘤如胃癌[4]、肝癌[5]、甲狀腺癌[6]、鼻咽癌[7]、腎透明細胞癌[8]中呈低表達,但在卵巢癌中的表達仍存在爭議。Iorio等[9]通過微列陣芯片研究發現miRNA-200家族中的 miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141在卵巢上皮癌中均顯著升高。Nam等[10]研究結果顯示miRNA-200家族在卵巢癌中高表達且和卵巢漿液性腺癌的不良預后相關。Dahiya等[11]篩查了34例上皮性卵巢癌和10個卵巢癌細胞系,發現miR-21,miR-200a,miR-141,let-7表達下降。Hu等[12]發現miR-200a的低表達與晚期卵巢癌的術后復發及低生存率相關,并可作為判斷卵巢癌預后差的指標。綜合以上各家研究結果,miR-200a在卵巢癌中表達并不一致,分析存在差異的原因,可能和檢測采用的方法,芯片,樣本量不同有關。

本研究采用Taqman探針實時熒光定量PCR法檢測發現miR-200a在上皮性卵巢癌中表達量顯著高于良性上皮性卵巢腫瘤組織(P<0.01),與Iorio和Nam等研究結果一致,說明miR-200a的高表達是上皮性卵巢癌的重要特征。晚期卵巢癌中表達水平低于早期卵巢癌(P<0.05),但總體表達水平仍高于良性卵巢上皮組織,在低分化組織中表達有明顯下降趨勢,說明在晚期卵巢癌中miRNA-200a的表達下調可能參與了卵巢癌的惡性進展和轉移。

許多研究表明腫瘤侵襲轉移的關鍵步驟在于發生了上皮-間質細胞轉化EMT(epithelial-to-mesenchymal transition),這種過程是指已分化的上皮細胞極性喪失獲得了間質細胞的表型,降低了細胞間的黏附而易脫落發生移,腫瘤細胞經過EMT過程就獲得了低分化、易侵襲和遠處轉移的特征[13]。E-cadherin是維持細胞間穩定的關鍵分子,其表達的丟失是發生EMT的重要標志,一些轉錄因子如ZEB1、ZEB2、Snail,可下調E-cadherin及上調間質來源的波形蛋白表達,從而引起EMT[14]。研究發現miRNA-200家族的靶基因之一是鋅指樣轉錄因子ZEB1和ZEB2,miR-200a通過 5′端種子序列(AACACU)與ZEB1/ZEB2 mRNA的 3′UTR互補結合,轉錄后抑制ZEB1/ZEB2基因的表達,從而負性調控E-cadherin的表達[15]。SM Park等發現miR-200a及其家族在表達E-cadherin的NCI60腫瘤細胞系中高表達,而在間質腫瘤細胞系中低表達或缺失,上調miRNA-200家族的表達能引起E-cadherin表達增高并抑制腫瘤細胞的遷移,相反,抑制miRNA-200家族的表達能明顯降低E-cadherin的表達并誘導EMT,促進腫瘤細胞侵襲和轉移[16]。Gregory等發現,microRNA-200家族在經TGF-β1誘導的乳腺腫瘤細胞發生EMT過程中下調,伴隨著E-cadherin mRNA水平的降低以及ZEB1/2水平的大幅升高[17]。E-cadherin在卵巢癌發生發展中呈現復雜的時相性,在正常卵巢上皮表達極少,在早期卵巢癌中E-cadherin表達增加,一旦卵巢癌發生轉移,E-cadherin表達顯著減少[18-19]。

與上述研究結果一致,本研究發現miR-200a的表達在早期卵巢癌中先升高,而在晚期卵巢癌顯著下降,亦呈現先高后低的時相性。其可能的機制是早期卵巢癌中miR-200a升高通過抑制其靶基因ZEB1/ZEB2的表達,上調E-cadherin的表達,在卵巢癌早期E-cadherin高表達可促進卵巢上皮細胞向惡性轉化。晚期卵巢癌中miR-200a明顯下降,其靶基因ZEB1/ZEB2的表達上調導致E-cadherin低表達,使腫瘤細胞低分化程度增加,促進EMT發生,腫瘤細胞間黏附功能喪失,從原發灶脫落,發生播散和轉移。另外有研究發現miRNA-200家族和ZEB1/2之間存在一個雙重負反饋環機制,miRNA-200家族通過轉錄后抑制ZEB1/2的表達,相反ZEB1/2也可通過抑制miRNA-200家族的轉錄來下調其表達,因而在腫瘤的發展中起重要作用[20]。

綜上所述,miR-200a在早期卵巢癌中高表達,而在晚期卵巢癌中低表達,提示 miRNA-200a可能作為原癌基因誘導了卵巢癌的發生,并參與卵巢癌的侵襲轉移。其可作為卵巢癌早期診斷和判斷預后的重要分子標志。但miR-200a在卵巢癌中表達失調的機制目前尚不明確,需進一步實驗探討其相關分子機制。

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