流式細(xì)胞儀計數(shù)造血干細(xì)胞的影響因素

蘇炳男，彭明婷

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院 衛(wèi)生部北京醫(yī)院 衛(wèi)生部臨床檢驗中心，北京 100730)

造血干細(xì)胞移植因其操作簡便，能快速重建造血和腫瘤細(xì)胞污染發(fā)生較少等優(yōu)點，已被廣泛用于治療多種惡性血液系統(tǒng)疾病、實體腫瘤、遺傳性疾病、重癥聯(lián)合免疫缺陷病等頑疾[1]。移植物中和患者體內(nèi)的造血干細(xì)胞數(shù)量對造血干細(xì)胞移植有重要的臨床意義，如決定造血干細(xì)胞的最佳采集時機(jī)、評判采集效果以及預(yù)測移植成功率等[2,3]。

早期一般使用檢測粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)的方法來間接反映移植物中的造血干細(xì)胞數(shù)量及增殖能力。但是其結(jié)果變異性大，耗時長(至少14d)，不利于臨床應(yīng)用[1]；單克隆抗體結(jié)合流式細(xì)胞儀計數(shù)CD34+細(xì)胞具有檢測快速、結(jié)果定量并可同時檢測CD34+細(xì)胞亞群等特點，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用。Bittencourt等人研究發(fā)現(xiàn)，移植物中CD34+細(xì)胞數(shù)大于3×106/kg的患者與小于3×106/kg的患者相比較，其移植相關(guān)累計死亡率低(19% vs.37%)，術(shù)后存活率高(64% vs.40%)[2]。而且，保證移植物中足夠的CD34+細(xì)胞數(shù)量還可以降低醫(yī)療花費。一項對1317份外周血采集物的調(diào)查研究顯示，移植物中CD34+細(xì)胞數(shù)大于5×106CD34+/kg的患者與小于5×106CD34+/kg的患者相比較，其平均住院時間短，抗生素、抗菌素和重組人粒細(xì)胞刺激因子(rhG-CSF)的平均使用量少，平均輸血次數(shù)少，因此每名患者平均可節(jié)省約3726 美金的醫(yī)療花費[3]。

因送檢的標(biāo)本中CD34+細(xì)胞的數(shù)量非常少(0.1～3%)，且流式細(xì)胞儀計數(shù)CD34+細(xì)胞過程中對結(jié)果產(chǎn)生影響的因素較多，各實驗室間結(jié)果存在很大的變異性。衛(wèi)生部臨床檢驗中心在2007年進(jìn)行的流式細(xì)胞儀計數(shù)CD34+細(xì)胞室間質(zhì)量評價項目的結(jié)果顯示，35家實驗室的相對計數(shù)結(jié)果變異性約為30%，絕對計數(shù)結(jié)果變異性約為50%。多篇國外文獻(xiàn)顯示，影響流式細(xì)胞儀計數(shù)CD34+細(xì)胞結(jié)果的主要影響因素有：分析方法、實驗室檢測技術(shù)及經(jīng)驗、檢測設(shè)備、抗體及熒光素和標(biāo)本處理過程[4-12]，控制這些影響因素可以有效地降低結(jié)果變異性。本文將對這些影響因素逐一闡述，并嘗試探討質(zhì)量控制方法及規(guī)范的檢測程序。

1 分析方法

1.1 單/雙平臺法 雙平臺法絕對計數(shù)結(jié)果的變異性要比單平臺法的變異性大[4-7]。雙平臺法絕對計數(shù)結(jié)果來源于流式細(xì)胞儀和血細(xì)胞分析儀：流式細(xì)胞儀獲取CD34+細(xì)胞百分率，血細(xì)胞分析儀計數(shù)白細(xì)胞(有核細(xì)胞)絕對濃度，這兩個結(jié)果相乘所得即為CD34+細(xì)胞絕對濃度；單平臺法絕對計數(shù)結(jié)果僅靠流式細(xì)胞儀即可獲得：CD34+細(xì)胞的絕對濃度可以間接地通過加入的已知濃度的熒光微球數(shù)來計算。Sutherland等人的研究顯示，單平臺法避開了計數(shù)結(jié)果中分母(有核細(xì)胞總數(shù))的影響，即不受血液分析儀結(jié)果變異性的影響，所以其CD34+細(xì)胞計數(shù)結(jié)果變異性較小[8]。根據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗中心2007年對國內(nèi)107家實驗室進(jìn)行的調(diào)查顯示，僅有10家實驗室使用了單平臺計數(shù)法。這可能是室間質(zhì)量評價絕對計數(shù)結(jié)果變異性大于相對計數(shù)結(jié)果變異性的主要原因。盡管單平臺法成本較高，對檢測人員要求較高，但使用單平臺法計數(shù)CD34+細(xì)胞可以更有效地降低實驗室間絕對計數(shù)結(jié)果的變異性[7]。

1.2 分析方案 目前大多實驗室使用的是在國際上被認(rèn)為最具準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的ISHAGE 方案。Sutherland 于1994年在他的研究中使用這種方法進(jìn)行分析，隨后這種方法被ISHAGE(International Society for Hematotherapy and Graft Engineering)收錄作為推薦方案使用，旨在確立一個普遍通用的，可有效排除實驗室內(nèi)或?qū)嶒炇议g差異的方案。該方案通過邏輯設(shè)門的方法排除干擾細(xì)胞，精確有效地計數(shù)CD34+細(xì)胞[9]。研究顯示，相比于ISHAGE方案，其他分析方案獲得的計數(shù)結(jié)果較低。例如，Milan 方案通過FSC和SSC 雙參數(shù)散點圖設(shè)門來確定作為分母的白細(xì)胞數(shù)。但是較低的FSC 閾值不能完全排除碎片、紅細(xì)胞和血小板，造成結(jié)果的分母偏大。而且該方案僅分析CD34 強(qiáng)陽性細(xì)胞，不分析弱陽性細(xì)胞，這也是造成該方案得到的計數(shù)結(jié)果較低的原因[5]。根據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗中心2007年對國內(nèi)107家實驗室進(jìn)行的調(diào)查顯示，僅有57家實驗室使用了ISHAGE 方案計數(shù)CD34+細(xì)胞；而根據(jù)英國國家實驗室間質(zhì)量評價機(jī)構(gòu)(United Kingdom National External Quality Assessment Service,UK NEQAS) 對101家實驗室的調(diào)查顯示，有80%的被調(diào)查實驗室都選用ISHAGE 方案，但是這些實驗室并不都能夠正確地使用該方案分析標(biāo)本：其中僅有57%的實驗室在分析過程中正確無誤地使用了該方案，其余的實驗室在使用該方案時都出現(xiàn)了一些錯誤，比如漏門、門的設(shè)置有誤等[10]。推廣并正確地使用ISHAGE 方案是提高我國實驗室計數(shù)CD34+細(xì)胞準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性的重要措施。

2 實驗室檢測人員技術(shù)及經(jīng)驗

實驗室檢測人員的技術(shù)及經(jīng)驗會對CD34+細(xì)胞計數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響。Guttridge等人的研究發(fā)現(xiàn)，技術(shù)熟練，經(jīng)驗豐富的檢測人員可以準(zhǔn)確地移取試劑和標(biāo)本，所以能夠得到更加準(zhǔn)確且穩(wěn)定的CD34+細(xì)胞計數(shù)結(jié)果[11-13]。Levering等人對不同實驗室進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，一些實驗室很少，甚至不參加權(quán)威機(jī)構(gòu)組織的室間質(zhì)量評價及質(zhì)量改進(jìn)項目，導(dǎo)致檢測人員經(jīng)驗不足，計數(shù)結(jié)果與其他實驗室差異較大[7]。根據(jù)衛(wèi)生部臨床檢驗中心2007年對107家實驗室的調(diào)查顯示，盡管有90余家實驗室表示參加過設(shè)備廠家組織的培訓(xùn)，但由于設(shè)備、試劑及培訓(xùn)人員水平不同，廠家培訓(xùn)并不規(guī)范。我國目前也沒有權(quán)威機(jī)構(gòu)開展該項目規(guī)范統(tǒng)一的培訓(xùn)。為保證計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性，臨床實驗室應(yīng)該參加權(quán)威機(jī)構(gòu)開展的室間質(zhì)量評價及質(zhì)量改進(jìn)項目，權(quán)威機(jī)構(gòu)應(yīng)開展此項目規(guī)范統(tǒng)一的培訓(xùn)，提高檢測人員技術(shù)及經(jīng)驗。

3 檢測設(shè)備

不同品牌、不同型號的流式細(xì)胞儀得出的檢測結(jié)果有差異。2007年衛(wèi)生部臨床檢驗中心對107家實驗室的調(diào)查顯示，有54家實驗室使用FACSCaliburTM，31家實驗室使用Epixs XLTM，18家實驗室使用FACScanTM，5家實驗室使用CytoronTM。Wilfried等人的研究顯示，與FACScanTM和Epixs XLTM這2種流式細(xì)胞儀相比，F(xiàn)ACSCaliburTM和CytoronTM獲得的相對和絕對計數(shù)結(jié)果均較高，但CytoronTM的結(jié)果變異性大[7]。任何一臺流式細(xì)胞儀，保證其穩(wěn)定的狀態(tài)及合適的參數(shù)，是獲得準(zhǔn)確計數(shù)結(jié)果的前提。應(yīng)使用熒光微球監(jiān)控流式細(xì)胞儀光路和液路的性能及狀態(tài)，并設(shè)定合適的參數(shù)靶值范圍。在計數(shù)CD34+細(xì)胞前，要使用FITC/PE熒光微球調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償。設(shè)置好相關(guān)條件后，使用造血干細(xì)胞計數(shù)質(zhì)控物來驗證熒光補(bǔ)償是否合適，并調(diào)節(jié)電壓。在接受調(diào)查的107家實驗室中有17家沒有使用光路流路校準(zhǔn)品、PMT 電壓校準(zhǔn)品以及顏色補(bǔ)償校準(zhǔn)品。而且由于進(jìn)口造血干細(xì)胞計數(shù)質(zhì)控品價格昂貴，有效期短，國內(nèi)沒有相關(guān)質(zhì)控品，有9家實驗室沒有使用質(zhì)控品。使用流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)品及造血干細(xì)胞計數(shù)質(zhì)控品，保證流式細(xì)胞儀性能和狀態(tài)，是獲得準(zhǔn)確穩(wěn)定的CD34+細(xì)胞計數(shù)結(jié)果的重要前提。

4 抗體及熒光素

4.1 抗體 不同的抗CD34 抗體得到的CD34+細(xì)胞計數(shù)結(jié)果也不同。根據(jù)結(jié)合的CD34 抗原位點的不同，抗CD34 抗體可以分為三類。結(jié)合I 類抗原位點的抗體在與熒光素結(jié)合后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抗體失去活性，特異性也會嚴(yán)重下降。而PE 標(biāo)記的針對Ⅱ類抗原位點的抗體能夠檢測標(biāo)本中所有CD34+細(xì)胞，但它一旦與FITC 結(jié)合后也會喪失一部分結(jié)合能力。現(xiàn)普遍推廣使用與III 類位點結(jié)合的抗體，這類抗體能有效地與多種熒光素結(jié)合，如FITC、PE、PerCP、APC和PE-CY5，而且能夠檢測標(biāo)本中所有的CD34+細(xì)胞[7]。

4.2 熒光素 抗體結(jié)合的熒光素會對CD34+細(xì)胞計數(shù)結(jié)果產(chǎn)生影響。PE 熒光素是目前使用最廣泛的與抗CD34 抗體結(jié)合的熒光素。與FITC 標(biāo)記的抗體相比，無論是絕對計數(shù)還是相對計數(shù)，使用PE結(jié)合的抗體得到的結(jié)果明顯更高。Levering等人的研究顯示，其原因是PE 有更強(qiáng)的熒光信號，可以更好的區(qū)分陽性和陰性細(xì)胞[7]。所以使用流式細(xì)胞儀計數(shù)CD34+細(xì)胞的最理想熒光素為PE 標(biāo)記的抗體。

5 標(biāo)本處理過程

5.1 標(biāo)本保存溫度和時間 標(biāo)本的保存溫度和時間對標(biāo)本細(xì)胞狀態(tài)有影響，進(jìn)而影響CD34+細(xì)胞計數(shù)結(jié)果。Gutensohn等人就保存溫度對標(biāo)本的影響的研究發(fā)現(xiàn)，外周血采集物在室溫條件下保存超過24h 后，CD34+細(xì)胞數(shù)量下降了約1/4；而在4℃條件下保存的標(biāo)本，CD34+細(xì)胞數(shù)量沒有明顯下降[14]。Szolomicka-Kurzawa 就保存時間對臍帶血的影響的研究發(fā)現(xiàn)，4℃條件下保存的臍帶血在離開人體內(nèi)環(huán)境的24h 內(nèi)，其CD34+細(xì)胞數(shù)目和狀態(tài)可保持穩(wěn)定，增殖能力良好，而48h 以后其細(xì)胞狀態(tài)及增值能力明顯下降[15]。在美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的流式細(xì)胞儀分析計數(shù)操作指南文件中，對不同類型抗凝劑/保存液保存的新鮮標(biāo)本可以保證計數(shù)準(zhǔn)確可靠的時間進(jìn)行了說明：EDTA 保存的標(biāo)本要在12～24h 之內(nèi)分析計數(shù)，肝素和ACD 保存的標(biāo)本要在48～72h 之內(nèi)分析計數(shù)[16]。實驗室收到標(biāo)本后，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，應(yīng)立即進(jìn)行檢測；若不能及時檢測，需將標(biāo)本置于4℃條件下保存，并在CLSI 文件推薦的時間內(nèi)進(jìn)行檢測。

5.2 溶血素 不同種類的溶血素對流式細(xì)胞儀計數(shù)CD34+細(xì)胞結(jié)果會造成影響。根據(jù)Bossuyt等人的研究發(fā)現(xiàn)，6種不同的溶血素 (①FACS Lysing Solution; ②Immunolyse Leucocyte Preparation System; ③ImmunoPrep Leucocyte Preparation System;④Optilyse B Lysing Solution；⑤Ortho-mune Lysing Reagent; ⑥ACK Lysing Buffer.)的效果各不相同。雖然所有的這些溶血素都能使CD34 陽性細(xì)胞明顯地與陰性群體區(qū)分開，但是使用Ortho-mune Lysing Reagent和ACK Lysing Buffer 兩種溶血素得到的結(jié)果大約要比使用其它溶血劑的結(jié)果高10%[17-19]。

5.3 標(biāo)本是否洗滌 溶血后不洗滌的標(biāo)本與溶血后洗滌的標(biāo)本相比，其CD34+細(xì)胞絕對計數(shù)結(jié)果更高。Levering等人的研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)本中CD34+細(xì)胞數(shù)量一般很少，洗滌會導(dǎo)致細(xì)胞丟失，對結(jié)果有很大的影響。而不洗滌的標(biāo)本中較多的細(xì)胞碎片、雜質(zhì)，可以通過合理的設(shè)門來排除[7]。

6 小結(jié)

保證造血干細(xì)胞計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性十分重要，但該項目影響因素較多，結(jié)果變異性較大。使用單平臺ISHAGE 方案進(jìn)行檢測分析是最有效的降低結(jié)果變異性的方法。其次，實驗室應(yīng)積極參加權(quán)威機(jī)構(gòu)開展的室間質(zhì)量評價及質(zhì)量改進(jìn)項目，保證儀器性能狀態(tài)，提高檢測人員技術(shù)及經(jīng)驗。另外，檢測時應(yīng)嚴(yán)格控制使用的試劑及標(biāo)本處理過程。

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