淺談抗菌肽的抗菌活性

陳紹平，趙建樂

（1.赤峰農牧學校，內蒙古赤峰024031；2.天津瑞普生物技術股份有限公司，天津300308）

抗菌肽（ABP）又稱為抗微生物肽（AMP）、宿主防御肽(HDPs)、肽抗生素，是動物免疫防御系統在外界條件刺激下，產生的一類對抗外源性病原體致病作用的具有免疫活性的多肽，是動物非特異性免疫防御系統的一個重要組成部分。依據其物種來源的不同，被分別命名為防御素、蛙皮素和蜂毒素等。抗菌肽有著分子量小、活性強、功能廣泛、殺菌譜廣等特點。抗菌肽的分子量一般在4kDa左右，肽鏈由12～50個氨基酸殘基組成，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、螺旋體、病毒(如流感病毒、皰疹病毒、人類HIV病毒)等均具有很強的殺傷活性。抗菌肽可以相對獨立地發揮抗菌功能，如果與其它因子（其它抗菌肽、乳鐵蛋白、溶菌酶等）協同作用，活性會明顯提高。目前，抗菌肽已成為免疫學和分子生物學研究的熱點。迄今為止，國內外分離鑒定的天然抗菌肽已經超過900種，并對多種抗菌肽進行了cDNA克隆測序、原核表達、真核表達，以及轉基因動物表達。本文根據當前各種抗菌肽的報道，通過比較不同種類抗菌肽的抗菌活性差別，對影響其抗菌活性的因素作一綜述。

一、不同種類抗菌肽的抗菌活性

1.昆蟲抗菌肽。昆蟲抗菌肽屬陽離子堿性多肽，可分為五種類型。①天蠶素，最早從天蠶的免疫血淋巴中分離得到，有A、B、C、D 4種類似體。目前已從鱗翅目和雙翅目昆蟲中分離出20多種天蠶素類抗菌肽,對各種大腸桿菌和其他革蘭氏陰性菌具有很強的活性，對革蘭氏陽性菌的殺滅作用比革蘭氏陰性菌弱，但對霉菌和其他真核細胞沒有細胞毒性作用。柞蠶抗菌肽對約40多種細菌有明顯殺滅效果，其中包括綠膿桿菌、金黃葡萄球菌、大腸桿菌及副傷寒桿菌耐藥性株等。通過在細菌細胞膜上形成電勢依賴性通道，改變細胞膜的通透性，造成細菌因細胞內容物外泄而死亡。②昆蟲防御素，最早是從半翅目昆蟲肉蠅中分離得到，曾一度被認為與哺乳動物的防御素同源而命名為昆蟲防御素，但二者的二硫鍵的連接方式以及三維空間構型截然不同。除雙翅目昆蟲外，在半翅目、鞘翅目、膜翅目、毛翅目和蜻蜓目昆蟲中都發現了昆蟲防御素。主要抗革蘭氏陽性菌，而對革蘭氏陰性菌、真菌及真核細胞幾乎無效，不引起血細胞溶血效應，其抗菌機制與天蠶素相似。③富含脯氨酸類抗菌肽，最早是在膜翅目的意大利蜂中發現。在鱗翅目、雙翅目、半翅目、鞘翅目昆蟲中也有發現。如存在于蜜蜂血淋巴中的Apidaecin和Abaecin，來自果蠅的Drosocin，來自無翅紅蝽的Pyrrhocoricin及來自碧蝽的Metalnikonins。該類抗菌肽主要作用于革蘭氏陰性菌，而對革蘭氏陽性菌沒有作用，其抗菌機理尚不清楚。④富含甘氨酸類抗菌肽，是近幾年才從天蠅、麻蠅中發現的一類抗菌肽。在鱗翅目、雙翅目、半翅目、鞘翅目、膜翅目昆蟲中都有發現，如從天蠶中分離的凝集素、來源于雙翅目昆蟲的雙翅肽，它們的抗菌譜較廣，推測此類抗菌肽中含量很高的甘氨酸可能對提高肽鏈彈性和廣譜抗菌機制起重要的作用。⑤ 抗真菌肽(AFP),最先是從麻蠅中分離出一種抗菌肽命名為AFP，隨后又發現了結構相似的holotricin。可抵抗真菌的感染，尤其是由白色念珠菌造成的感染，抗真菌肽可通過細胞ATP的非裂解性釋放來殺死真菌，釋放的ATP隨后與嘌呤功能受體結合，激活細胞毒性路徑。

2.哺乳動物抗菌肽。哺乳動物抗菌肽由骨髓細胞或上皮細胞產生，有著十分廣泛的抗菌譜。六個保守的半胱氨酸形成的三個穩定的二硫鍵，是區別于其他抗菌肽的主要特征之一。哺乳動物的抗菌肽包括：上皮組織中的防御素、呼吸道中的表面活性物質陰離子抗菌肽（SAAPs）以及大量存在于白細胞中的Cathelicidins。其中Cathelicidins是一類具有寬抗菌譜、高效殺滅細菌活性的抗菌肽，能在微摩爾濃度有效殺滅細菌。豬的抗菌肽有，在小腸的潘氏細胞中分離到 的 PR-39、Cecropin P1和 NK-lysin；骨髓中分離到的PMAP；白細胞中分離到的PGs。牛的抗菌肽包括，在氣管上皮發現的TAP和舌上皮的LAP，兩者均屬于防御素家族；以及存在于嗜中性粒細胞的Bac7、Bac5、Bactencin、β-defensins、indohcidin等。人的抗菌肽種類很多，多數屬于防御素類，而hCAP-18是迄今在人體發現的Cathelicidins家族的唯一成員。hCAP-18酶解后釋放出的LL-37，在人體組織中廣泛分布，具有廣譜抗微生物作用、中和內毒素作用和趨化作用，是人體天然免疫的重要多功能分子。兔的MCP-1和MCP-2，由肺巨噬細胞產生，屬于防御素家族，同樣具有廣譜的抗菌活性。

豬的Cecropin P1是第一個從腸組織分離到的抗菌肽，與昆蟲的天蠶素Cecropin A和Cecropin B分別有64%和75%的同源性，泌尿生殖道正常生長的乳酸桿菌對其有高度抗性，且與牛的indolacidin、蛙的buforin Ⅱ及一些抗生素聯合用藥無協同作用；PGs可抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌等多種性傳播病菌，其中PG-1具有廣譜的抗細菌和真菌的作用，可在體外殺死很多革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌等。PR-39在低濃度下可以抗革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌菌)、革蘭氏陽性菌(如巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、釀膿鏈球菌、結核分支桿菌)，不裂解野生型大腸桿菌，但對突變型K12有作用，通過阻斷細菌蛋白質和DNA的合成，從而導致這些成分的降解。牛的Bac7，Bac5屬于Cathelicidins類抗菌肽，兩者的氨基酸序列與人、兔、大鼠的防御素類抗菌肽無同源性，也不同于蛙皮素和天蠶素；Bactenecin是環狀的十二肽，在分子的中部形成一個環鏈，對野生型革蘭氏陰性菌特別敏感，與脂多糖有很高親和力，從而有利于滲透細菌外膜，抗菌活性強；從羊白細胞分離到的OaBac5、ChBae5與牛的Bac5同源，并在低鹽濃度下仍有抗菌活性，這類Bac 5在反芻動物中高度保守，對于其先天防御體系有利。

3.蛙類的抗菌肽。目前發現的蛙類抗菌肽種類很多，有蛙皮素、Bombinin-likes、Brevinins,以及從澳洲蛙類中提取到的抗菌肽：Caerins、Citropins、Maculatins、Uperins等。蛙皮素是一組非洲蟾蜍皮膚中的廣譜抗菌肽,對于細菌、真菌、酵母以及原生生物都有作用，MagaininⅡ是一個代表性的抗菌肽，它與細菌細胞膜中陰離子脂靜電識別，形成肽-脂超分子復合物孔道，但由于MagaininⅡ疏水性較低，不能和組成哺乳動物細胞膜的兩性離子磷脂有效結合，所以對正常真核生物細胞低毒。青蛙皮膚產生的Brevinins，有較強的抗菌活性。CaerinⅠ是一組從幾種樹蛙中分離得到的具有廣譜抗菌活性的抗菌肽，結構和功能的研究都較為清楚。

4.水生動物抗菌肽。水生動物的抗菌肽包括魚類抗菌肽和水生甲殼動物抗菌肽。魚類抗菌肽不僅具有抗菌作用，而且是美容營養成分，具有用于化妝品的獨特優勢和廣泛的市場潛力。同一種魚的不同組織會產生不同的抗菌肽，且不同的魚類，抗菌肽的差異很大，所以魚類抗菌肽的種類非常多且同源性不大。依據它們在結構上的一定共性和特點歸為四種類型：①不含半胱氨酸，可以折疊成疏水或雙親性α螺旋結構。主要有Pardaxin和Misgurin。Pardaxin是豹鰨體表粘液中的抗菌肽，活性比蜂毒素更強，溶血活性更低；Misgurin是泥鰍體內的抗菌肽，有較強的體外廣譜抗菌活性且沒有明顯的溶血作用，其抗菌活性是蛙皮素magaininⅡ的6倍以上。此外，虹鱒的Salmocidin，美洲黃蓋鰈的Pleurocidin也屬于這一類。②含有多個半胱氨酸，可以折疊成β結構。如虹鱒的Hepcidin。③分子結構與組蛋白高度相似的組蛋白樣蛋白(HLPs)。如鯰的Parasin I，斑的3種HLPs，鮭魚的SAM 都同屬此類抗菌肽。其中，Parasin I無溶血作用，廣譜抗菌，且活性是蛙皮素的12～100倍。④具有糖基化修飾的抗菌肽。

水生甲殼動物（如蝦、蟹、鱟）的抗菌肽不僅具有抗菌作用而且具有與幾丁質結合的活性。從青園蟹中分離到的3種抗菌肽，與牛的Bactenecin-7高度一致；從鱟分離到的抗菌肽，類似于兔和牛的防御素；從南美白對蝦中分離出的3種抗菌肽Penaeidins，是獨特的帶負電荷抗菌肽，主要抗革蘭氏陽性菌和真菌。

5.細菌抗菌肽。已發現的細菌抗菌肽包括：桿菌肽、短桿菌肽S、多黏菌素E、乳鏈球菌肽（Nisin）。桿菌肽主要作用于革蘭氏陽性菌，通過抑制革蘭氏陽性菌胞漿內的肽聚糖前體轉變為焦磷酸萜醇，從而起到抑菌作用，對耐藥的金黃色葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、螺旋體、放線菌有效，但對革蘭氏陰性菌無效；而短桿菌肽S對革蘭氏陰性菌和白色念珠菌具有很強的活性。多黏菌素E能通過破壞細胞膜而起到殺菌作用，對大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、布魯氏菌、弧菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌等均有效，尤其對綠膿桿菌具有強大的殺菌作用，應用黏桿菌素氣霧劑治療肺部綠膿桿菌感染已取得成功。乳鏈球菌肽，是lantibiotic類抗菌肽，通過抑制細菌蛋白質合成起到抑菌作用，若與EDTA共用可提高對革蘭氏陽性菌的抑制效果；與乳鐵蛋白結合亦可更好地抑制單增李斯特氏菌。

二、抗菌肽的抗菌機制

抗菌肽的多種抗菌途徑使得抗菌肽的殺菌過程非常迅速，一般不超過5分鐘。目前，被國內外認可的抗菌機制有：抗菌肽的膜裂解機制和非膜裂解機制。膜裂解機制是指抗菌肽疏水端有插入細菌質膜的傾向，進而形成受電動勢調節的孔洞，使膜的完整性受損，通透性增加，引起胞內水溶性物質大量滲出，從而最后導致細菌死亡。目前還有柵桶式、膠粒聚合和毯式，三種對于膜裂解機制的補充解釋。隨著研究的深入，人們還發現了抗菌肽的非膜裂解的抗菌機制：①誘導細胞調亡。②攻擊線粒體。③影響細胞染色體。④抑制細胞外膜蛋白和細胞壁的形成。目前發現的抗菌肽多種作用機制中，膜裂解機制被認為是最主要作用途徑，且一種抗菌肽可以通過多種途徑來發揮作用。

三、影響抗菌肽抗菌活性的因素（略）

四、結語

抗菌肽的抗菌活力很高，具有著取代抗生素的獨特優勢和廣泛的市場潛力。但是，若要抗菌肽真正成為商品化藥物，還有很多問題需要解決：

（1）如何提高抗菌肽的產量及降低成本，已成為目前抗菌肽投入大規模生產應用的瓶頸。直接從動植物組織中分離提純分子量較小的天然抗菌肽，存在一定的困難，而合成肽價格又太昂貴。因此，人們期望利用基因工程將抗菌肽基因轉化進微生物表達系統或導入動植物體內，以改造物種獲得優良抗病品種。

（2）需要深入研究結構與功能的關系，設計更高生物活性的抗菌肽分子。天然抗菌肽的抗菌活性還不夠理想，但是，抗菌肽的氨基酸殘基數量少，結構特點鮮明，易于合成，便于改造，可以通過對現有抗菌肽及其衍生物進行化學修飾；或者，組裝新型肽類合成模板，來得到更多抗菌肽骨架化學結構；或者，利用得到的化學結構為母體進行化學合成。以上這些方法都需要進一步研究抗菌肽的結構與活性之間的關系，為抗菌肽分子的改造和設計提供足夠的理論依據。

（3)抗菌肽的安全性問題。抗菌肽的使用安全性研究至今尚無資料表明抗菌肽的體內外毒性問題。許多天然抗菌肽都有溶血作用，并且一些抗菌肽如蜂毒素、蜂毒肽、蝎毒素、植物抗菌肽等對正常真核細胞具有潛在的毒性。

（4）關于抗菌肽的藥效學、藥代動力學及體內應用的穩定性的研究還很少，抗菌肽代謝的半衰期及代謝產物是否對機體體有害還不清楚，而且不能確定肽類物質在被吸收入血流后，是否會被血流內的蛋白水解酶降解。人們正在嘗試，通過應用前體藥物、結合耐蛋白水解酶的肽類或進行序列修飾等方法來解決其穩定性的問題。

隨著對抗菌肽研究的進一步深入，可以設計出具有特定性質的新型抗菌肽，驗證其抑菌活性，進行毒理學研究之后，用基因工程的方法獲得大量的產品，不失為新藥開發的一條捷徑，并有望開發高效低毒的小分子抗菌肽。

（略）