原核表達PRRSV結構蛋白構建活載體疫苗的研究進展

韋志強

（四川省成都市溫江區農村發展局，四川 成都 611130）

1 免疫預防現狀

目前在生產上應用的主要是商品化弱毒苗，幾種商品化弱毒苗在減少PRRS疾病損失方面發揮了一定的作用，但PRRS疫苗的使用仍然存在著不少問題:（1）疫苗毒能在豬體內持續性存在，能從免疫豬傳給非免疫豬，從免疫豬群傳到非免疫豬群，公豬免疫后可通過精液傳播，母豬免疫后可經胎盤造成胎兒的先天性感染；（2）血清型不同時，保護作用不完全，且持續時間較短，對于新出現的超強毒株則完全無保護作用；（3）疫苗免疫后并不能明顯減少強毒株在豬群內的傳播；（4）疫苗毒能返強而致病，免疫后抗體水平低下時，有誘發ADE作用的可能，反而使病情加劇。因此，對于PRRS弱毒疫苗應采取謹慎使用的態度，研制高效安全的疫苗乃當務之急。

2 PRRSV結構蛋白及活載體疫苗開發

隨著新型疫苗的不斷涌現，PRRS活載體疫苗也逐漸成為國內外研究的熱點。活載體疫苗主要針對PRRSV的三種主要結構蛋白:GP5/E蛋白（囊膜糖蛋白）、ORF6編碼膜基質蛋白（M蛋白）及OFR7編碼核衣殼蛋白（N蛋白）。

2.1 GP5/E蛋白 PRRSV E基因長603 bp左右，編碼GP5糖基化包膜蛋白（又稱E蛋白），在所有結構蛋白中是變異程度最高的一種蛋白，但GP5是重要的抗原保護性蛋白，能誘導高滴度的中和性抗體，具有最強的中和能力，在保護性免疫應答中發揮重要作用。Rodrigue等研究缺失跨膜區的GP5基因在大腸桿菌中獲得良好的表達，且表達產物可與PRRS陽性血清發生陽性反應。Gonin等將PRRSV-GP5克隆到融合有GST蛋白基因的pGEx-4T-1載體中，結果其表達產物可用于病毒血清學檢測。谷紅等將中國分離的BJ-4株缺失N端疏水序列的PRRSV-dGP5克隆到原核高效表達載體pGEX-4T-2中，在E.coli BL21細胞中成功表達了重組蛋白GST-dGP5，表達產物以包涵體形式存在，表達量為20.8%，利用融合肽進行親和層析得到高純度的重組蛋白。陳建君等將中國GD株GP5克隆到原核表達載體pBAD/g III C中，將該片段定向插入到轉化大腸埃希氏菌中，重組質粒用阿拉伯糖誘導表達，用Western blotting鑒定表達蛋白，結果證明GP5基因得到表達。目前國內外學者雖然已對E蛋白的本質及其原核表達、免疫反應特征、在保護性免疫中的作用等方面進行了大量的研究工作，并取得了較大的進展，但仍有很多方面尚不十分明確。

2.2 ORF6編碼的非糖基化蛋白（M蛋白） ORF6基因長525bp左右，編碼M蛋白，具有高度保守性。在所有蛋白中M蛋白刺激引起的T細胞增殖反應最為強烈，可見M蛋白與PRRSV誘導的細胞免疫有關。另外，M蛋白上至少存在4個線性抗原表位和3個構象性表位，能誘導低滴度的中和抗體產生，這對PRRSV基因工程疫苗的設計具有重要的指導意義。王嬌等采用原核表達載體pET-32a（+）表達了河北地方珠PRRSV-ORF6蛋白，經Western-blotting分析表明，表達蛋白與陽性血清發生了特異性反應。綜合這些研究結果，一方面可以利用該原核表達產物建立反映機體抗體水平的特異性診斷方法；另一方面，該特異性抗體的制備對以M蛋白為基礎的PRRSV新型基因工程疫苗的研制以及對疫苗激發免疫反應的檢測提供了基礎材料。

2.3 ORF7編碼核衣殼蛋白（N蛋白） N基因及其編碼蛋白長372bp左右，主要編碼核衣殼蛋白，是一種堿性磷酸蛋白，N蛋白和M蛋白一樣具有高度保守性，N蛋白的抗原位點分散于整個N蛋白上，沒有一個N蛋白氨基酸片段能模擬完整N蛋白的抗原性，且美洲型毒株和歐洲型毒株的N蛋白上存在著能發生交叉反應的保守性抗原位點，同時也存在著不同反應性的特異性抗原表位，這些針對共同抗原表位的特異性單抗，對于PRRSV的診斷以及鑒別美洲型和歐洲型PRRSV感染均具有重要意義。與其他蛋白相比，N蛋白激發的體液免疫反應最強，機體產生的PRRSV抗體主要是針對N蛋白的。另外，豬感染PRRSV后，針對各種結構蛋白的抗體成分的出現時間不同，而N蛋白抗體出現較早，最早于感染后一周即可檢出N蛋白抗體，且N蛋白抗體維持時間較長，其下降速度也明顯慢于M和GP5抗體。因此，N蛋白可作為診斷抗原用于PRRS的抗體檢測。國內外學者利用此原理對ORF7基因進行了原核高效表達，以達到診斷應用的要求。夏平安等將N蛋白基因亞克隆到原核表達載體pET-32a中，構建了重組表達質粒pET-N，用Western blotting分析純化后的融合蛋白，結果顯示出良好的生物學活性；再利用純化融合蛋白作包被抗原，同時優化ELISA反應條件，建立了可檢測抗PRRSV N蛋白抗體的間接ELISA方法（N-ELISA），并將所建立的N-ELISA與國外進口的PRRS檢測試劑盒IDEXX-ELISA同時對200份臨床送檢血清進行平行檢測，結果陽性符合率為92.7%，表明本試驗建立的N-ELISA與IDEXX-ELISA具有同樣高的特異性。

3 結語

目前國內外的研究顯示原核表達系統能高效表達PRRSV的主要結構蛋白，并經體外試驗檢測，所表達的蛋白抗原具有很好的免疫原性，這對開發研制新型的高效免疫疫苗及診斷方法具有重要意義。

[1]Mardassi H，Mounir S，Dea S.Molecular analysis of the ORF3-7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus，Quebec reference strain[J].Arch Virol.，1995，140:1405-1418.

[2]谷 紅，楊漢春，郭 鑫，等.PRRSV BJ-4株ORF5基因的原核表達與重組蛋白的純化[J].畜牧獸醫學報，2004，35（1）:64-69.

[3]陳建君，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東株ORF5基因在大腸桿菌中的表達 [J].動物醫學進展，2005，26（5）:66-68.

[4]王 嬌，孫繼國，陳賽娟，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表達[J].中國動物檢疫，2009，26（4）:34-36.

[5]夏平安，尹彥濤，李素平，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組N蛋白的高效表達及間接ELISA方法的建立[J].中國獸醫學報，2009，29（5）:537-541.