水稻逆境響應基因OsMsr11的克隆與分析

胡葉平，崔延春，徐國云，王曼玲，李落葉，夏新界

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界上60%的人口以其為主食[1]，在我國水稻也是第一大糧食作物，但是水稻在生產過程中常常遭遇季節性，區域性的干旱、高溫、低溫等逆境脅迫，嚴重影響我國水稻的產量和品質。由于全球氣候變化和全球沙漠化進程的加速，非生物脅迫將會加劇，因此，研究水稻對逆境的適應機理，發掘新的水稻耐逆基因，應用現代生物技術培育出能適應暫時不利條件或者能生活在嚴酷條件下的水稻品種已成為當今水稻分子育種家聚焦的重點之一。

植物在遭受低溫、高溫、干旱等逆境脅迫時，會引起許多相關基因表達的變化，導致一系列形態學、生理代謝功能、生物化學以及分子上的改變，這些變化直接或間接影響植物自身的生長和產量。首先，植物為了適應環境，在長期演化過程中形成了一系列對環境脅迫的抵抗或忍耐能力，即植物的耐逆性；其次，植物在逆境脅迫時，會引起耐逆相關基因表達的變化，一類是直接參與代謝與生理變化的效應基因，它們通過控制代謝酶或蛋白的表達影響代謝與生理過程，這些酶或蛋白對維持細胞膜系統在逆境下的穩定性以及防止原生質過度脫水等有重要作用；另一類是調節基因[2]，它們通過控制其下游許多逆境誘導基因的表達而間接影響代謝與生理過程。研究表明某些信號轉導途徑也參與逆境反應，但是目前有關非生物逆境信號轉導中受體的信息是非常有限的[3]。例如，反向遺傳學研究表明AHK1/ATHK1（擬南芥跨膜組氨酸激酶）在酵母細胞中是一個滲透反應受體[4，5]，但是其下游信號傳導機制大部分都未知，這還需要科學家的進一步研究。

由于分子生物學技術和方法在植物學中的應用，許多耐逆相關基因已經從各種植物中分離出來，功能也逐漸清楚。例如，Goel等[6]發現的細菌codA基因在轉基因番茄中表達可以誘導甜菜堿的合成并能提高植株對鹽脅迫和水分脅迫的抵抗力；Lee等[7]報道的胡椒CaAMP1基因在擬南芥中過量表達能夠增加轉基因植株的耐鹽、耐旱性。基因OsMsr2[8]在苗期葉片和孕穗期穗在低溫脅迫下，表達水平分別上調約52.3倍和68.2倍，研究表明該基因編碼鈣結合蛋白，在擬南芥中過量表達此基因增強了轉基因擬南芥的耐鹽性、耐旱性，還增加了對外源ABA的敏感性。所有這些耐逆基因的編碼產物直接保護植物細胞免受逆境脅迫或者調控其他基因的表達而提高植物對逆境的忍受能力[9,10]。雖然許多耐逆基因已被分離，但鑒于眾多基因參與逆境反應和眾多耐逆基因的存在，克隆更多新的植物耐逆基因并了解它們的功能，無論是對研究植物耐逆性分子機理還是對作物的遺傳改良都具有重要的理論和實際意義。本文是在分析水稻全基因組耐逆反應基因芯片數據的基礎上，篩選出的其中一個耐逆相關基因，為研究其在耐逆反應中的作用，對該基因進行了序列分析和克隆、構建了過量表達載體、采用農桿菌侵染法進行了水稻的遺傳轉化，并對轉基因水稻進行了初步的功能分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

材料為超級稻(Oryza sativa L.ssp.Indica)兩優培九母本培矮64S(種子由湖南省農業科學院水稻研究所提供)和父本9311(種子由湖南師范大學生命科學學院徐孟亮研究員提供)。

1.2 試劑

DNA Polymerase(TaKaRa LA Taq)、克隆載體 pMD18-T連接試劑盒、限制性內切酶購于寶生物工程(大連)有限公司，dNTP、DNALadder Marker購于天根生化科技(北京)有限公司，PCR引物由Invitrogen公司合成，其他試劑均為分析純。大腸桿菌感受態細胞DH10B為本實驗室制備并于-80℃保存。

1.3 試驗處理與取材

種子用0.1%HgCl2消毒10 min，自來水沖洗3遍，25℃浸種3 d，每天換水1次，37℃催芽2 d-3 d，分批播于中國科學院亞熱帶農業生態研究所網室盆中，當秧苗生長至5葉期時，一部分作為苗期實驗材料；另一部分移栽至其他盆中，每盆栽5株，繼續置網室自然條件下生長發育，常規水肥管理與病蟲防治，作為孕穗期與抽穗開花期的實驗材料。

干旱脅迫處理：倒去盆中水層，置旱棚逐干，當葉片開始卷曲16 h后取材，對照也置旱棚，但盆中保持水層。高溫脅迫處理：將盆中泥水溫調至45℃，置于美國Percival公司生產的PGC1515人工氣候箱中用45℃處理2 h后取材；對照置于另一PGC1515人工氣候箱中，溫度為28℃。處理與對照均為黑暗條件。低溫脅迫處理：將材料置于PGC1515人工氣候箱中，苗期4℃處理12 h后取材，孕穗期與抽穗開花期12℃處理16 h后取材，對照置于另一PGC1515人工氣候箱中，溫度為28℃。處理與對照均為黑暗條件。

每個處理與對照材料取4-5片倒二葉、4-5個未抽出的幼穗或已抽出的開花穗中部，剪碎，用液氮磨成干粉狀，立即分裝入5-6個事先裝有1.0 ml TRIzol提取液(Invitrogen)的1.5 ml離心管中，每管中約裝100 mg粉狀樣品，編號，蓋緊，搖動，使樣品與TRIzol提取液充分混合，置-80℃保存備用。

1.4 總RNA提取

采用TRIzol試劑提取法。將-80℃保存備用的樣品取出，解凍后，加200μL氯仿，振蕩混勻，4℃，12,000 rpm離心15 min，小心吸出上層水相，轉入另一離心管，加500μL異丙醇，沉淀、離心分離出RNA，再經75%酒精洗滌，室溫微干后，加適當體積的RNase-free水，充分溶解，測量RNA濃度。

1.5 基因芯片分析

按Affymetrix基因芯片系統中國經銷商上海晶泰生物技術有限公司(GeneTech Biotechnology Limited Company)提供的Affymetrix表達芯片實驗操作手冊操作(2005年版)。主要步驟包括：①總RNA的提取和純化；②cDNA的合成和純化；③體外轉錄合成cRNA和cRNA的純化；④cRNA片段化、配制雜交液；⑤芯片雜交；⑥洗脫芯片；⑦掃描芯片；⑧數據分析。

1.6 過量表達載體的構建和水稻的遺傳轉化

從GenBank中搜索到OsMsr11的同源序列，應用Vector NTI 11軟件分析設計該基因的PCR引物，上游引物5'端設有Sma I酶切位點，上游引物OsMsr11-F序列為：5'-CCCGGG GTGTGTTCTTCATCATCGCC-3'，下游引物OsMsr11-R序列為5'-CCTATAAGTGGGTTCGGTTC-3'，引物由Invitrogen合成，以培矮64SDNA為模板進行PCR擴增；擴增程序為：95℃預變性4 min，94℃變性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個循環，最后在72℃下延伸10 min。擴增、回收目的片段并連接到pMD18-T載體，篩選含有目的片段的陽性克隆，送Invitrogen公司測序。將測序正確的pMD18-T載體用SmaⅠ進行單酶切后連入pCOsAc(來自pCAMBIA1301含有水稻ACTINI基因的啟動子和Nos終止子)，同時用pmacⅠ酶切表達載體PCOsAc質粒并對切開的PCOsAc載體片段去磷酸化處理從而構建成pCOsAc-OsMSR11表達載體。將構建好的表達載體利用農桿菌介導法導入超級稻父本9311愈傷組織中，通過共培養、潮霉素篩選獲得再生植株。

1.7 轉基因株系陽性鑒定

從水稻新鮮葉片中提取基因組DNA，根據表達載體上跨終止子序列設計引物，Primer-F:5′-GGTGTGTTCTTCATCAT CGCC-3′，Primer-R:5′-ATTCCCGATCTAGTAACATAGATGA CA-3′，PCR反應參數為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s,60℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環35次；72℃后延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離。預期PCR產物片段長為662 bp。

1.8 轉基因株系的逆境處理

轉基因植株T1代種子耐鹽性實驗：將轉基因種子與9311野生型種子分別播放在鋪有2層濾紙的培養皿中，每皿10粒，重復3次。NaCl濃度分別0 mM，150 mM，每皿分別加10 ml，對照培養皿中加入10 ml水,培養在室溫條件下，3d后統計萌發情況（胚芽露出），統計后讓其繼續在原來的條件下生長12d，觀察生長情況并統計數據。

轉基因植株T1代種子ABA敏感性實驗：將轉基因種子與野生型對照種子分別在加有0μM、2μM、4μM、6μMABA的1/2 MS培養基中萌發(轉基因種子和野生型種子處于同一條件下，分別10粒)，重復3次，培養在溫室中，兩周后觀察生長情況。

2 結果分析

2.1 OsMsr11是一多逆境脅迫誘導表達的基因

為了發掘新的耐逆功能基因，采用Affymetrix基因芯片系統，分析了超級稻兩優培九母本培矮64S(含51279個轉錄本)在苗期、孕穗期、抽穗開花期的葉片與穗在高溫、干旱、低溫逆境脅迫下的基因表達水平，篩選出一批顯著上調或下調的基因，OsMsr11是一個在低溫、干旱、高溫條件下均誘導表達的基因(圖1)。在低溫處理的幼穗中，表達水平上調幅度達126.2倍，在干旱條件下最高上調幅度為2倍，在高溫條件下最高上調幅度為11.27倍。相比之下此基因對低溫最為敏感。

圖1 水稻培矮64S不同生育時期不同組織器官中OsMsr11基因在不同逆境與正常條件下的表達水平

2.2 OsMsr11基因的克隆與序列分析

為了進一步研究OsMsr11在水稻耐逆過程中的作用，從GenBank中搜索到此基因在日本晴第8號染色體上的同源DNA序列（AP004460.2，19434-20130 bp之間），根據此同源序列設計基因特異性引物，因在日本晴第8號染色體上的同源基因沒有內含子，本實驗用培矮64S基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到含完整開放閱讀框架（open reading frame,ORF）的OsMsr11基因DNA片段（圖2），然后連接到pMD18-T載體上，測序后對其序列進行分析發現，該DNA序列包含366個堿基（含有ORF），基因序列的ORF位于堿基48bp-282bp之間（圖3），其序列與GenBank中公布的日本晴基因組序列AP004460.2和超級雜交稻親本9311序列CM000133.1相對應的堿基相比，不存在堿基差異。該基因與日本晴基因NM_001188461.1（NP_001175390蛋白）103bp-346bp之間的堿基序列同源性為91%，與高粱基因XM_002443838.1(XP_002443883蛋白)112bp-260bp之間堿基同源性為88%，與高粱基因XM_002443840.1(XP_002443885蛋白)100bp-298bp之間的堿基同源性為78%，與大豆基因BT092720.1(ACU17030蛋白)同源性為41.5%，與北美云杉基因EF081477.1(ABK20880蛋白)168bp-255bp之間的堿基序列同源性為72%。

圖2 OsMsr11 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

圖3 OsMsr11基因序列、推測的編碼蛋白序列及預測的啟動子區域順式作用元件

根據該基因所對應的日本晴相應基因組DNA序列(AP004460.2，Range:19539-19770)可能的啟動子區域(AP004460.2，Range:19500-18001)進行在線PlantCARE軟件分析(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，在啟動子TATA-box上游，發現了5類與逆境相關的順式作用元件(圖3)，它們可能參與此基因對逆境脅迫的響應。

2.3 OsMsr11基因編碼蛋白質序列及比對分析

采用Vector NTIAdvance 11.0軟件對此序列進行分析，OsMsr11完整的ORF長度為234 bp，編碼77個氨基酸殘基的蛋白，預測分子量為8.38 KD，pI約為8.79。蛋白質相似性比對 (圖4)分析顯示，OsMsr11全長蛋白序列與秈稻9311第8號染色體上OsI_27861基因編碼的蛋白序列(EAZ05643.1，hypothetical protein)、日本晴第8號染色體上OsJ_26087基因編碼的蛋白序列(EAZ41563.1，hypothetical protein)完全一致。OsMsr11全長序列與Os08g0156033基因編碼的蛋白序列(BAH94118.1，Conserved hypothetical protein)相似性為 87%，與高粱第7號染色體上SORBIDRAFT_07g003730基因編碼的蛋白序列 (XP_002443883.1，hypothetical protein)相似性為69%。OsMsr11蛋白1-51間位氨基酸序列與高粱SORBIDRAFT_07g003745基因編碼的蛋白序列(XP_002443885.1，hypothetical protein)的6-56位間的相似性為75%，OsMsr11蛋白4-55位氨基酸序列與大豆ACU17030.1蛋白序列的3-54位間相似性為52%，4-77位氨基酸序列與北美云杉ABK20880.1蛋白序列的3-64位間的相似性為41%，4-50位氨基酸序列與葡萄XP_002274232.1蛋白序列的3-49位間相似性為55%，9-50位間氨基酸序列與蓖麻XP_002528939蛋白序列的8-49位間相似性為57%，4-53位氨基酸序列與擬南芥EFH43878.1蛋白序列的3-52位間相似性為48%。以上與OsMsr11基因編碼蛋白相似的預測蛋白全為功能未知蛋白。

圖4 OsMsr11編碼蛋白與其他類似蛋白的比對分析注：右側數字代表每行最后1個氨基酸的序號,進行比對的植物蛋白質包括BAG88611.1（OsMsr11）、NP_001061023.1、NP_001175390.1、XP_002443883.1、XP_002443885.1、ACU17030.1、ABK20880.1、XP_002274232.1、XP_002528939.1、XP_00286761。“*”代表高度保守的氨基酸殘基，“:”代表保守性極高的位點，“.”代表保守性稍低的殘基位點，“-”代表序列間無一致性位點。

利用ProtParam工具(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)分析OsMsr11蛋白的20種氨基酸中Ala所占比例最高，達到13%，而沒有Trp，此蛋白的不穩定指數為36.05，脂肪指數為71.04，總平均親水性為-0.481，消光系數在280 nm處為5960，根據此工具分析說明此蛋白穩定。使用ProtSca(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)對此蛋白序列進行疏水性分析顯示：OsMsr11蛋白1-21位氨基酸之間為疏水區域，22-77位氨基酸之間為親水區域(圖5)，這與ProtParam中總平均親水性預測結果一致。利用SignalP3.0 server對OsMsr11 N端進行信號肽預測表明此蛋白有信號肽序列，最可能的剪切位點在21-22之間，其功能蛋白為一親水性蛋白?；贖MM算法的預測結果可知，此蛋白存在信號肽的可能性為0.822，綜合NN算法和HMM兩種算法可知，OsMsr11基因編碼蛋白含有信號肽序列，此蛋白可能為分泌性蛋白，可能在信號識別中起作用。使用TargetP1.1對OsMsr11的亞細胞定位進行預測，結果表明可能是分泌通路信號肽，分泌到細胞周質中，預測剪切位點的序列為21個氨基酸，與SignalP3.0 server預測結果一致。

2.4 轉OsMsr11基因水稻的鑒定與耐逆性分析

對獲得的再生植株用表達載體跨終止子特異性引物進行PCR檢查，進一步篩選轉基因植株，結果顯示有9株植株擴增出662 bp的目的基因片段(圖6)，表明目的基因已成功整合到這些水稻的基因組中。

圖5 OsMsr11蛋白疏水性預測分析

為了分析過量表達OsMsr11是否改變轉基因水稻的耐鹽性與對ABA的敏感性，從中篩選出3株進行鹽脅迫處理與ABA敏感性實驗，結果均表現出不同程度的耐鹽性提高與對ABA敏感性的降低，其中H7株系最為明顯（圖7，8）。在正常條件下，轉基因和野生型植株的萌發率、莖長和根長沒有差異，在150 mMNaCl條件下，轉基因植株的萌發率、莖長和根長明顯高于野生型，且差異顯著(表1、2)。在對ABA敏感性的分析中，發現在0μM和2μMABA的培養基中轉基因植株和野生型植株的莖長差異不顯著，在4μM和6μM ABA的培養條件下，轉基因植株的莖長明顯高于野生型且差異顯著(圖8，表3)，上述獲得的結果表明：OsMsr11的過量表達提高了水稻的耐鹽能力，同時降低了對ABA的敏感性；OsMsr11基因的過量表達在水稻中可能是通過參與了不依賴ABA信號傳導途徑來調節對鹽的耐受力，可能編碼一個植物應答ABA的信號傳導途徑中的一個負調控因子參與調控水稻幼苗莖的生長發育，具體的作用機制還需進一步研究驗證。

圖6 PCR分析鑒定轉基因水稻植株

圖7 過量表達OsMsr11基因水稻和野生型水稻對鹽脅迫的耐受力

圖8 轉基因和野生型植株在不同ABA濃度下幼苗生長情況

表1 過量表達OsMsr11基因水稻在鹽脅迫下的萌發率統計

表2 過量表達OsMsr11基因水稻在150 mM NaCl脅迫下的根長、莖長統計

表3 過量表達OsMsr11基因水稻在不同ABA濃度下的莖長

3 結論與討論

3.1 結論

OsMsr11基因是通過基因芯片技術篩選到的一個逆境條件下表達水平上調的基因。通過對該基因的序列分析發現，該基因無內含子，啟動子區域含有5個逆境相關的順式作用元件；對蛋白序列分析發現其親水性較強，無典型的保守結構域，含有信號肽序列，預測其為分泌性蛋白質。通過對轉基因水稻的耐逆性分析得出如下結論：

（1）OsMsr11基因是一個受逆境誘導的基因。

（2）水稻中過量表達OsMsr11基因降低了轉基因植株對外源ABA的敏感性。因此OsMsr11基因可能編碼一個應答ABA信號傳導途徑中的負調控因子。

（3）水稻中過量表達OsMsr11基因提高了轉基因植株的耐鹽性。

3.2 討論

OsMsr11基因是一個受高溫、低溫、干旱誘導表達水平上調的基因。在低溫條件下，孕穗期穗和抽穗開花期的表達水平較高，特別是在低溫條件下孕穗期穗中的表達水平上調最為顯著，說明此基因對低溫比較敏感。另有報道證實OsMsr11基因在受亞砷酸鹽(AsIII)和砷酸鹽(AsV)脅迫時其表達水平也上調[11]，表明此基因有可能參與水稻對砷脅迫的響應。OsMsr11基因編碼的蛋白質親水性比較強，在逆境中可能具有一定的脫水保護劑的作用。Wise等[12]報道的LEA蛋白具有較高的親水性，在逆境條件下能夠保護細胞或膜結構，恢復變性蛋白的活性等從而增加植物的耐逆性。植物參與耐逆性的功能基因大致可分為兩大類：一類是控制代謝酶或蛋白質活性的效應基因，它們直接參與代謝與生理變化過程，通過調節滲透勢，維護膜穩定性以及蛋白質構象與穩定，調節和加強植物自身代謝生理保護機制；另一類是調控其下游特異靶基因表達的調節基因[2]，它們間接影響代謝與生理過程，使植物獲得抵御脅迫的能力。OsMsr11基因編碼蛋白N端信號肽的預測表明此蛋白可能屬于分泌性蛋白質，其可能是逆境相關基因的第一類即控制代謝酶或蛋白質活性的效應基因。這類基因調控合成滲透調節物質的酶類基因，調節某些滲透調節物質的合成，從而提高了植物的耐逆性，例如，P5CS1是控制脯氨酸合成的關鍵限速酶，在植物抗逆中發揮重要作用[13]。

真核生物基因轉錄水平調控，特別是轉錄因子直接與順式作用元件結合來調控靶基因，這種調控方式在逆境脅迫下基因表達調控中較為普遍[14]，植物基因啟動子區域發現了多種與逆境相關的順式作用元件，在轉錄水平上參與調控下游相應基因的表達，從而使植物應對不同的外界環境脅迫[15]。本研究在OsMsr11基因上游的可能啟動子區域發現了ABRE/G-box、ARE、CGTCA-motif、GARE-motif這 5 類順式作用元件，以往的研究證明這些順式作用元件以及與其相互作用的轉錄因子在ABA響應及植物耐逆過程中發揮重要的作用[16]。在OsMsr11基因上游的順式作用元件中，其中3類是激素相關順式作用元件，表明它們可能與信號傳導途徑有關，而激素信號傳導途徑與植物的耐逆性相關[17]，這些順式作用元件的存在進一步說明其可能參與植物的耐逆響應過程。

本研究對OsMsr11轉基因水稻進行了初步的功能分析，表明OsMsr11基因的過量表達降低了對外源ABA的敏感性，增強了轉基因水稻的耐鹽性，說明OsMsr11可能編碼一個植物應答ABA的信號傳導途徑中的一個負調控因子。但是大多數研究結果表明，對ABA高敏感的植物是通過調節氣孔關閉和ABA相關基因的表達從而提高植物對高鹽、干旱的耐受力[18]。Jung等[19]報道AtMYB44基因的過量表達增加了擬南芥植株對ABA的敏感性，降低葉片失水率，明顯增加了轉基因擬南芥的耐旱性和耐鹽性；Xu等[8]報道的OsMsr2基因在擬南芥中過量表達增強了轉基因擬南芥的耐鹽、耐旱性，同時也增加了對外源ABA的敏感性。而本文報道的OsMsr11基因的過量表達降低了對ABA的敏感性，卻增加了對鹽的耐受力，這與以往大多數研究結果不同，但是也有與本文實驗結果類似的報道。Lee等[7]發現擬南芥中過量表達胡椒CaAMP1基因能夠增加轉基因植株的耐鹽、耐旱性，但同時降低了對ABA的敏感性。轉基因水稻中實驗結果顯示OsMsr11基因的過量表達提高耐逆性，這一過程有可能是通過一種未知的負調控機制來調控ABA抗逆信號途徑實現的，從而使轉基因水稻具有抗逆性。到目前為止有關此基因的功能研究在本文中為首次報道，更深入的耐逆性方面研究正在進行中。參考文獻：

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