川芎茶調(diào)顆粒HPLC指紋圖譜研究

梅基雄 張麗艷 謝宇 劉冬蘭 唐靖雯

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002;2.貴州威門股份有限公司，貴州 貴陽 550002

川芎茶調(diào)顆粒原方出自于宋《太平惠民和劑局方》。方中由川芎、白芷、羌活、細辛、防風(fēng) 、薄荷、荊芥和甘草等幾味中藥組成。該制劑疏風(fēng)止疼，主治風(fēng)邪頭痛，或有惡寒，發(fā)熱，鼻塞。臨床上常應(yīng)用于外感風(fēng)邪引起的感冒頭痛也可用偏頭痛、神經(jīng)性頭痛或外傷后遺癥所致的頭痛［1］，也有結(jié)合其他藥物治療鼻炎的報道［2］。川芎茶調(diào)顆粒為“國家基本藥品目錄”收載品種。

目前，川芎茶調(diào)顆粒未見指紋圖譜方面的研究報道，川芎茶調(diào)顆粒的質(zhì)量控制方面的研究文獻報道也較匱乏。因中藥指紋圖譜技術(shù)現(xiàn)已成為評價中藥質(zhì)量的有效手段［3］。本文通過建立川芎茶調(diào)顆粒HPLC指紋圖譜，對川芎茶調(diào)顆粒進行質(zhì)量評價，為川芎茶調(diào)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供研究依據(jù)。

1 儀器及試劑

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀 (四元梯度泵、自動進樣器、DAD檢測器、Chemstation色譜工作站)，80－2臺式低速離心機，AG135型電子天平 (梅特勒－托利多公司)，中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系 (2004A版)。

1.2 試藥 甘草酸銨 (購自中國藥品生物制品檢定所，批號110731－201116);乙腈 (色譜純，美國TEDIA);正丁醇 (分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司);甲醇 (分析純，上海振興化工一廠);娃哈哈純凈水 (杭州娃哈哈集團)，其余試劑均為分析純。供試品有貴州威門藥業(yè)提供，批次見表1。

表1 10批次川芎茶調(diào)顆粒批號

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonisil(R)鉆石C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm);流動相:A:乙腈，B:0.05%甲酸溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表1;檢測波長:254nm;流速:1ml/min;柱溫:20℃。

表2 洗脫程序表

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品5g，研細，精密加入25ml50%乙醇溶液，加熱回流30分鐘，放冷，補重，搖勻，離心10分鐘 (4000轉(zhuǎn)/分鐘)，吸取上清液10ml置蒸發(fā)皿中，蒸干，用5ml水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，分次用水飽和正丁醇萃取三次，每次25ml，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70%甲醇溶解，定容至5ml，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品適量，加70%甲醇制成每1ml含0.5mg的對照品溶液，搖勻，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取同一批次供試品溶液20μL，按照上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積比值基本一致，RSD均小于3%，在同一臺儀器上相似度均大于0.99，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批次供試品溶液20μL，按照上述色譜條件，分別于0、6、12、18、24、36、48h測定，記錄色譜圖。各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積比值基本一致，RSD均小于3%，在同一臺儀器上相似度均大于0.99，符合指紋圖譜技術(shù)要求，結(jié)果表明，供試品溶液在48 h內(nèi)樣品溶液的成分穩(wěn)定。

2.5.3 重現(xiàn)性試驗 分別精密量取同一樣品6份，按供試品溶液方法制備，分別進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積比值基本一致，RSD均小于3%，在同一臺儀器上相似度均大于0.99，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.6 指紋圖譜的建立 分別取10批次的川芎茶調(diào)顆粒，按供試品溶液方法制備，精密吸取供試品溶液20ul注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進行檢測，記錄135min的色譜圖。

2.7 指紋圖譜的分析

2.7.1 共有峰的標(biāo)定 比較10批次樣品的色譜圖，標(biāo)定22個色譜峰為共有峰，見圖1。其中20號峰為川芎茶調(diào)顆粒顆粒指標(biāo)性成分甘草酸銨峰，該峰吸收強，峰面積大，故選此峰作為參考峰。共有峰相對保留時間見表3，共有峰相對峰面積見表4。

表3 10批川芎茶調(diào)顆粒共有峰的相對保留時間

表4 10批川芎茶調(diào)顆粒共有峰的相對峰面積

共有峰81 0.191 0.170 6 0.133 0.120 0.109 0.132 0.113 0.113 0.119 0.155 0.215 0.201 7 0.140 0.092 0.077 0.085 0.168 0.078 0.104 0.106 0.123 0.107 8 0.226 0.202 0.192 0.172 0.202 0.191 0.208 0.214 0.27 0.245 9 0.489 0.199 0.178 0.340 0.229 0.156 0.184 0.266 0.399 0.320 10 0.296 0.254 0.231 0.206 0.272 0.235 0.291 0.296 0.364 0.257 11 0.379 0.309 0.279 0.342 0.406 0.314 0.413 0.496 0.629 0.559 12 0.327 0.382 0.291 0.245 0.361 0.331 0.345 0.308 0.654 0.567 13 0.392 0.295 0.256 0.255 0.373 0.268 0.372 0.546 0.889 0.767 14 0.101 0.083 0.056 0.072 0.092 0.065 0.114 0.103 0.144 0.121 15 0.066 0.055 0.051 0.068 0.056 0.065 0.105 0.084 0.103 0.100 16 0.120 0.107 0.075 0.112 0.114 0.087 0.166 0.149 0.201 0.169 17 0.073 0.060 0.037 0.161 0.204 0.040 0.151 0.055 0.070 0.060 18 0.149 0.137 0.121 0.109 0.120 0.076 0.197 0.168 0.119 0.197 19 0.087 0.083 0.085 0.100 0.106 0.090 0.106 0.091 0.095 0.090 20(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 21 0.114 0.111 0.073 0.096 0.125 0.15 0.124 0.099 0.106 0.065 22 0.150 0.152 0.163 0.156 0.179 0.179 0.191 0.S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 5 0.077 0.068 0.069 0.090 0.073 0.066 0.072 0.0 138 0.121 0.143

2.7.2 相似度評價 應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系 (2004A版)計算10批樣品的相似度，評價其色譜峰相似度的一致性，10批次相似度均大于0.9，10批次川芎茶調(diào)顆粒指紋圖譜結(jié)果見圖2，相似度結(jié)果見表3。

表5 10批次川芎茶調(diào)顆粒相似度

3 討論

本實驗考察了50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、50%甲醇、70%甲醇以及100%甲醇的提取溶劑的提取效率，結(jié)果50%乙醇提取出峰數(shù)量多，吸收較強，故選擇作為提取溶劑。回流提取與超聲提取的效率基本相同，但回流提取的譜圖中某些峰的響應(yīng)值略高，且實驗過程中，回流提取的樣品較穩(wěn)定，故選擇回流提取為本實驗的提取方法。考察不同波長下的指紋圖譜，在254nm處出峰數(shù)多，分離度高，故選擇254nm為檢測波長。

本實驗考察了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－0.05%甲酸、甲醇 －0.02%磷酸、乙腈 －0.02%磷酸、乙腈 －0.02%磷酸、乙腈－0.02%三乙胺，結(jié)果顯示在乙腈－0.05%甲酸 (梯度洗脫)流動相條件下，柱效較高，出峰均勻。色譜圖中各個色譜峰分離度較好，且基線平穩(wěn)，故選擇乙腈－0.05%甲酸為流動相系統(tǒng)。

通過10批次川芎茶調(diào)顆粒指紋圖譜可以看出，其相似度均大于0.9，證明同一廠家生產(chǎn)的川芎茶調(diào)顆粒質(zhì)量穩(wěn)定，為川芎茶調(diào)顆粒質(zhì)量控制水平的提升奠定一定的研究基礎(chǔ)。

［1］林曉蘭.川芎茶調(diào)顆粒臨床應(yīng)用情況分析［J］.北京中醫(yī)，2004，23(3):90－192.

［2］朱優(yōu)立，王琳，馬崧.川芎茶調(diào)顆粒沖劑治療急性鼻竇炎的臨床觀察［J］.實用診斷與治療雜志，2005，19(9):69.

［3］羅國安，梁瓊麟，王義明.中藥指紋圖譜［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2009:1.