大鼠部分肝移植（PLT）的肝葉切除方法及體會

宋 康 賀軼鋒 周 儉 黃曉武 孫 健 王曉穎 王 征 潘 奇 樊 嘉

（復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所肝外科 上海 200032）

由于器官缺乏的現狀，目前臨床部分肝移植（partial liver transplantation，PLT）如活體和劈離式肝移植日益受到重視，已成為一項重要的肝移植技術并被廣泛應用［1］。PLT有著與全肝移植不同的肝再生過程［2］，手術操作復雜，術后血管膽道并發癥較多，更有因為PLT體積不能滿足受者的代謝需求而發生“小肝綜合征”［3］。有研究提示［4］，在肝癌肝移植術后，PLT的肝癌復發率明顯升高，但其機制尚不明確。因此通過建立PLT的動物模型，深入研究其相關機制，是當前肝移植研究的重要課題，對于提高臨床肝移植的整體療效具有重要意義。

采用Kamada二袖套法血管吻合技術的大鼠肝移植模型，是目前肝移植研究領域中應用最廣、較為理想的動物模型。大鼠PLT的建立方法已有報道［5－7］，但手術方式和成功率不盡相同。在既往研究的基礎上［8－9］，我們通過不同的肝葉切除方法，建立了相應比例的大鼠部分肝移植模型，移植后存活率較高。

材料和方法

實驗動物及分組清潔級雄性近交系SD（Sprague－Dawley）大鼠150只，由中國科學院上海實驗動物中心提供，體重250～300g，隨機分為3組（每組供受體各25只），供體較受體體重略輕。分組為離體切肝的60%PLT組，在體切肝的60%PLT組和30%PLT組。所有大鼠在清潔恒溫、12h晝夜生活環境中分籠飼養；術前禁食12h，自由飲水；術中乙醚吸入麻醉。所有操作程序符合實驗動物使用規范。

供肝獲取大鼠全身肝素化后，腹部“十”字形切口進腹。游離肝下下腔靜脈，結扎右腎靜脈和右腎上腺靜脈。解剖第一肝門，顯露膽總管。將膽道支架管（麻醉用硬膜外導管制成）自膽總管下段插入至左右肝管會合部下方約2mm處，結扎固定。結扎肝食管交通支，縫扎左隔下靜脈。在體切肝的60%PLT組，在冷灌注前（血供未斷的條件下），切除左外葉、尾葉，保留中葉、右葉、右前葉；30%PLT組，在體切除左外葉、尾葉、右葉、右前葉，僅保留中葉；離體切肝的60%PLT組，則在冷灌注獲取全肝后，再切除左外葉及尾葉。冷灌注前，灌注針在左右髂總動脈分叉處向近心端插入游離后的腹主動脈，剪開膈肌，止血鉗阻斷胸主動脈，貼近右心耳處剪斷肝上下腔靜脈，左腎靜脈水平剪斷肝下下腔靜脈，建立流出道，0～4℃乳酸林格氏液（每毫升含25IU肝素）開始冷灌注，灌注高度約50cm，灌注流量約2．5 mL／min。2～3min后待肝臟呈現均勻的土黃色后，逆時針方向分離肝周韌帶。解剖游離門靜脈，分離切斷肝動脈，依次結扎切斷胃冠狀靜脈、脾靜脈，距脾靜脈結扎點下方2mm處切斷門靜脈，停止冷灌注。切斷肝后韌帶和膈肌，取出肝臟浸沒于器官修整皿中的0～4℃乳酸林格氏液中。

在體切除左外葉剪開左外葉的韌帶，充分顯露門靜脈左支及左外支。7－0Prolene線縫扎距門靜脈左外支蒂部遠側約5mm處，縫扎范圍約5mm，左外葉立刻出現約1／2～2／3的缺血區，剪開縫扎線遠側約5mm范圍的肝組織。微血管鉗鉗夾距左外葉蒂部約5mm處的缺血肝組織，移除血管鉗后沿鉗夾痕，6－0Prolene線結扎切除左外葉。此處應注意結扎的力度和方向，避免左外葉蒂部的過度收縮。

在體切除尾葉剪開尾葉表面的鞘膜及韌帶，在舒展狀態下，6－0Prolene線在其蒂部環扎后切除。

在體切除右前葉解剖第一肝門，分別游離顯露右肝管和門靜脈右支，7－0Prolene線距左右支分叉約3mm處分別縫扎切斷。剪開右前葉表面的鞘膜及韌帶，在其根部距下腔靜脈約3mm處，6－0 Prolene線環扎后切除。

在體切除右葉剪開表面的鞘膜及韌帶，向上翻起后顯露肝右靜脈。在其根部距下腔靜脈約3 mm處，7－0Prolene線縫扎肝右靜脈，縫扎范圍約5 mm，剪開縫線遠側的部分肝組織。微血管鉗將6－0 Prolene線穿過剪開處，距下腔靜脈約3mm處，分別環扎右葉根部剩余的左右側肝組織，將其切除。

供肝修整及離體肝葉切除剔除門靜脈、肝下下腔靜脈周圍的多余組織后，分別套管（動脈介入鞘管制成）。沿膈肌環切除膈肌，剪開隔膜，在肝上下腔靜脈開口左右側角處分別預置7－0Prolene線。離體切肝的60%PLT組，牽引固定預置縫線，減少供肝在冰浴中的滑動；6－0Prolene線環扎切除尾葉；解剖分離左外葉韌帶，7－0Prolene線縫扎距門靜脈左外支蒂部遠側約5mm處，縫扎范圍約5 mm，剪開縫扎線遠側約5mm范圍的肝組織，距左外葉蒂部約5mm處微血管鉗鉗夾剩余肝組織，沿鉗夾痕6－0Prolene線結扎切除左外葉。

受體手術術前30min肌注阿托品0．03mg，正中切口進腹。順時針方向依次剪開鐮狀韌帶，縫扎左隔下靜脈，結扎肝食管交通支，游離肝下下腔靜脈，結扎右腎上腺靜脈，分離肝后韌帶至膈肌環，游離肝上下腔靜脈。解剖第一肝門，縫扎切斷肝動脈，左右肝管分叉處結扎切斷膽總管，游離門靜脈至左右支分叉處。無創血管夾分別阻斷門靜脈和肝下下腔靜脈，停止吸入乙醚。在門靜脈左右支分叉處穿刺注射常溫乳酸林格氏液約2mL；去除肝臟內血液并擴容。7－0 Prolene線分別縫扎門靜脈左右支后，無創血管夾向兩側牽引縫線。Satinsky鉗阻斷肝上下腔靜脈，貼近肝臟剪斷肝上下腔靜脈，門靜脈左右支分叉處剪斷門靜脈，腎靜脈上方剪斷肝下下腔靜脈，移除肝臟。將供肝原位置入腹腔，表面予含0～4℃保存液的濕棉片保護。供肝預置縫線連續縫合肝上下腔靜脈的后壁、前壁。將供肝門靜脈套管置入受體門靜脈后環扎固定，開放門脈血流，移除阻斷肝上下腔靜脈的Satinsky鉗。同法吻合肝下下腔靜脈。將膽道支架管插入受體膽總管，結扎固定。溫熱生理鹽水沖洗腹腔，關腹前自陰莖背靜脈注射常溫生理鹽水2mL。

術后處理受體大鼠復溫至自主活動后，放入單籠飼養。術后自由飲水，第2天起自由進食。觀察一般狀態和存活情況，死亡病例均解剖確定死因。

結 果

肝葉切除后的供肝比例 在體切肝的60%PLT組，供肝與原肝重比為56．6%～62．9%，平均為59．7%；30%PLT組為29．5%～34．3%，平均為31．9%。離體切肝的60%PLT組，供肝與原肝重比為58．2%～64．5%，平均為61．2%。

各實驗組的供肝比例均達到手術預期的60%和30%。

術后存活情況和死亡原因在體切肝的60%PLT組，1周存活率為88%，術后1天死亡1例，原因為肝中葉左側份壞死；術后2～7天死亡2例，原因分別為肝中葉左側份壞死（1例）和全中葉壞死（1例）。在體切肝的30%PLT組，1周存活率為64%，術后1天死亡3例，原因分別為肝斷面滲血（2例）和小肝綜合征（1例，表現為大量腹水、腸腔高度擴張）；術后2～7天死亡6例，原因分別為肺炎（2例）和小肝綜合征（4例）。

離體切肝的60%PLT組，1周存活率為72%，術后1天死亡3例，原因分別為肝斷面滲血（1例）和肝中葉左側份壞死（2例）；術后2～7天死亡4例，原因分別為肝右葉壞死（1例）和肝中葉左側份壞死（3例）。

討 論

建立模擬臨床過程的動物模型是進行肝移植基礎研究的前提。作為理想的動物模型，大鼠PLT術的關鍵在于獲取與臨床PLT比例相似的部分供肝。在臨床實踐中，PLT的比例常通過供肝體積與受體理想肝體積的比值來計算，30%為下限［10］。本實驗通過切除不同的肝葉組合所獲取的60%和30%比例供肝，與臨床PLT相似。

大鼠的肝臟分為左外葉、尾葉、中葉、右前葉和右后葉［5］，可以采取切除不同的肝葉組合來達到獲取不同比例部分供肝的目的。通過對大鼠肝臟解剖結構的觀察，切除左外葉和尾葉可以獲取約60%比例的供肝；切除左外葉、尾葉、右葉、右前葉可以獲取約30%比例的供肝，這與本實驗的結果吻合。鑒于部分移植術后的肝再生過程中可能發生的血管膽道扭轉的因素，本實驗保留肝中葉的方法，可以避免上述并發癥的發生。在既往研究中，我們也通過切除左外葉、尾葉、肝中葉左側份獲取了50%比例的供肝；由于肝中葉較寬厚，且包繞下腔靜脈，切除左側份后，常發生肝斷面的滲血和膽漏，導致手術失敗和存活率較低。我們也曾嘗試通過僅保留肝中葉右側份作為供肝，來建立20%PLT模型，由于上述肝中葉解剖因素所致的并發癥及術后發生的小肝綜合征，此比例大鼠部分肝移植的成功率很低。

60%PLT組的死亡病例多見肝中葉左側份、甚至全中葉的壞死。通過解剖發現，大鼠門靜脈左外支進入左外葉蒂部前，發出一側支進入肝中葉左側份，因此保留這一側支對于保證肝中葉的血供尤為重要。在體切除左外葉時，門靜脈系統的顯露十分清晰，通過顯微操作在距蒂部約5mm處切除左外葉，可以避免大塊結扎造成殘余組織的過度收縮和擠壓，保證了肝中葉的血供，降低了受體大鼠的死亡率。由于左外葉切除后殘余蒂部的炎癥壞死可能累及門靜脈側支，所以仍有少數受體術后出現肝中葉壞死。我們采用相同的方法在大鼠肝切除模型中行左外葉切除，盡管術后也存在殘端炎癥，但無一例發生肝中葉壞死。我們推測這與移植模型的供肝僅有門脈性供血有關。離體切肝的60%PLT組術后出現了較多的肝中葉壞死，這可能由于離體切肝時縫扎、結扎的方向和力度不易掌控，容易造成殘余組織的擠壓變形；另外離體狀態下的門靜脈系統顯露較差，切肝時不能充分保護門靜脈，影響了供肝的血供。

30%PLT組中，很少發生肝中葉壞死，但小肝綜合征多見，主要表現為大量的腹水和腸腔的高度擴張［9］，手術成功率和存活率明顯降低。作為小體積供肝，30%比例已接近PLT的下限［10］，其承受了更高的門靜脈壓力，比60%比例更能保證肝葉的血供，所以較少出現肝中葉壞死；然而門靜脈高壓又會加重移植物損傷，造成有效肝容量的進一步減少，導致了小肝綜合征和移植物無功能的發生。

本實驗采用了在體和離體切肝兩種方式獲取部分供肝。在體切肝因能較為精準地控制縫扎和結扎的范圍、力度和方向，能及時發現肝斷面的滲漏情況，其手術成功和存活率較高；離體切肝時，若能注意上述操作細節，充分保護門靜脈血供，避免下腔靜脈的縮窄，也可取得較好的手術效果。由于保留了供肝獲取前的血供，在體切肝的方式與臨床活體肝移植相似；而在冰浴中的離體切肝，則能模擬臨床劈離式肝移植的過程。

我們在既往研究的基礎上，通過在體切肝或者離體切肝的方式獲取部分供肝，分別建立了較為穩定的60%和30%比例大鼠PLT模型，能較好地模擬臨床部分肝移植過程，為深入進行肝移植的基礎研究提供了良好平臺。

［1］ Said A，Einstein M，Lucey MR．Liver transplantation：an update 2007［J］．CurrOpinGastroenterol，2007，23（3）：292－298．

［2］ Yao AH，Yang Y，Li XC，etal．Hepatic regenerative response in small－sized liver isografts in the rat［J］．J SurgRes，2010，161（2）：328－335．

［3］ Gruttadauria S，Pagano D，Luca A，etal．Small－for－size syndrome in adult－to－adult living－related liver transplantation［J］．WorldJGastroenterol，2010，16（40）：5011－5015．

［4］ Vakili K，Pomposelli JJ，Cheah YL，etal．Living donor liver transplantation for hepatocellular carcinoma：increased recurrence but improved survival［J］．Liver Transpl，2009，15（12）：1861－1866．

［5］ Omura T，Ascher NL，Emond JC．Fifty－percent partial liver transplantation in the rat［J］．Transplantation，1996，62（2）：292－293．

［6］ 鮑國清，王以巧，沈柏用．三種不同方法小體積大鼠肝移植模型建立的比較［J］．上海醫學，2010，33（6）：576－578．

［7］ 李江，劉靜，侯宇，等．30%小體積肝移植大鼠模型的手術技巧及改良［J］．中國組織工程研究及臨床康復，2011，15（18）：3341－3346．

［8］ 宋康，樊嘉，周儉，等．大鼠部分肝移植模型的建立［J］．復旦學報：醫學版，2007，34（2）：307－309．

［9］ 宋康，樊嘉，周儉，等．二氮嗪預處理對大鼠小體積肝移植缺血再灌注損傷的保護作用及對肝再生的影響［D］．復旦大學博士論文，2008：9－13．

［10］ Hill MJ，Hughes M，Jie T，etal．Graft weight／recipient weight ratio：how well does it predict outcome after partial liver transplants［J］．LiverTranspl，2009，15（9）：1056－1062．