大鼠部分肝移植（PLT）的肝葉切除方法及體會(huì)

宋 康 賀軼鋒 周 儉 黃曉武 孫 健 王曉穎 王 征 潘 奇 樊 嘉

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所肝外科 上海 200032）

由于器官缺乏的現(xiàn)狀，目前臨床部分肝移植（partial liver transplantation，PLT）如活體和劈離式肝移植日益受到重視，已成為一項(xiàng)重要的肝移植技術(shù)并被廣泛應(yīng)用［1］。PLT有著與全肝移植不同的肝再生過(guò)程［2］，手術(shù)操作復(fù)雜，術(shù)后血管膽道并發(fā)癥較多，更有因?yàn)镻LT體積不能滿(mǎn)足受者的代謝需求而發(fā)生“小肝綜合征”［3］。有研究提示［4］，在肝癌肝移植術(shù)后，PLT的肝癌復(fù)發(fā)率明顯升高，但其機(jī)制尚不明確。因此通過(guò)建立PLT的動(dòng)物模型，深入研究其相關(guān)機(jī)制，是當(dāng)前肝移植研究的重要課題，對(duì)于提高臨床肝移植的整體療效具有重要意義。

采用Kamada二袖套法血管吻合技術(shù)的大鼠肝移植模型，是目前肝移植研究領(lǐng)域中應(yīng)用最廣、較為理想的動(dòng)物模型。大鼠PLT的建立方法已有報(bào)道［5－7］，但手術(shù)方式和成功率不盡相同。在既往研究的基礎(chǔ)上［8－9］，我們通過(guò)不同的肝葉切除方法，建立了相應(yīng)比例的大鼠部分肝移植模型，移植后存活率較高。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)雄性近交系SD（Sprague－Dawley）大鼠150只，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重250～300g，隨機(jī)分為3組（每組供受體各25只），供體較受體體重略輕。分組為離體切肝的60%PLT組，在體切肝的60%PLT組和30%PLT組。所有大鼠在清潔恒溫、12h晝夜生活環(huán)境中分籠飼養(yǎng)；術(shù)前禁食12h，自由飲水；術(shù)中乙醚吸入麻醉。所有操作程序符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范。

供肝獲取大鼠全身肝素化后，腹部“十”字形切口進(jìn)腹。游離肝下下腔靜脈，結(jié)扎右腎靜脈和右腎上腺靜脈。解剖第一肝門(mén)，顯露膽總管。將膽道支架管（麻醉用硬膜外導(dǎo)管制成）自膽總管下段插入至左右肝管會(huì)合部下方約2mm處，結(jié)扎固定。結(jié)扎肝食管交通支，縫扎左隔下靜脈。在體切肝的60%PLT組，在冷灌注前（血供未斷的條件下），切除左外葉、尾葉，保留中葉、右葉、右前葉；30%PLT組，在體切除左外葉、尾葉、右葉、右前葉，僅保留中葉；離體切肝的60%PLT組，則在冷灌注獲取全肝后，再切除左外葉及尾葉。冷灌注前，灌注針在左右髂總動(dòng)脈分叉處向近心端插入游離后的腹主動(dòng)脈，剪開(kāi)膈肌，止血鉗阻斷胸主動(dòng)脈，貼近右心耳處剪斷肝上下腔靜脈，左腎靜脈水平剪斷肝下下腔靜脈，建立流出道，0～4℃乳酸林格氏液（每毫升含25IU肝素）開(kāi)始冷灌注，灌注高度約50cm，灌注流量約2．5 mL／min。2～3min后待肝臟呈現(xiàn)均勻的土黃色后，逆時(shí)針?lè)较蚍蛛x肝周韌帶。解剖游離門(mén)靜脈，分離切斷肝動(dòng)脈，依次結(jié)扎切斷胃冠狀靜脈、脾靜脈，距脾靜脈結(jié)扎點(diǎn)下方2mm處切斷門(mén)靜脈，停止冷灌注。切斷肝后韌帶和膈肌，取出肝臟浸沒(méi)于器官修整皿中的0～4℃乳酸林格氏液中。

在體切除左外葉剪開(kāi)左外葉的韌帶，充分顯露門(mén)靜脈左支及左外支。7－0Prolene線(xiàn)縫扎距門(mén)靜脈左外支蒂部遠(yuǎn)側(cè)約5mm處，縫扎范圍約5mm，左外葉立刻出現(xiàn)約1／2～2／3的缺血區(qū)，剪開(kāi)縫扎線(xiàn)遠(yuǎn)側(cè)約5mm范圍的肝組織。微血管鉗鉗夾距左外葉蒂部約5mm處的缺血肝組織，移除血管鉗后沿鉗夾痕，6－0Prolene線(xiàn)結(jié)扎切除左外葉。此處應(yīng)注意結(jié)扎的力度和方向，避免左外葉蒂部的過(guò)度收縮。

在體切除尾葉剪開(kāi)尾葉表面的鞘膜及韌帶，在舒展?fàn)顟B(tài)下，6－0Prolene線(xiàn)在其蒂部環(huán)扎后切除。

在體切除右前葉解剖第一肝門(mén)，分別游離顯露右肝管和門(mén)靜脈右支，7－0Prolene線(xiàn)距左右支分叉約3mm處分別縫扎切斷。剪開(kāi)右前葉表面的鞘膜及韌帶，在其根部距下腔靜脈約3mm處，6－0 Prolene線(xiàn)環(huán)扎后切除。

在體切除右葉剪開(kāi)表面的鞘膜及韌帶，向上翻起后顯露肝右靜脈。在其根部距下腔靜脈約3 mm處，7－0Prolene線(xiàn)縫扎肝右靜脈，縫扎范圍約5 mm，剪開(kāi)縫線(xiàn)遠(yuǎn)側(cè)的部分肝組織。微血管鉗將6－0 Prolene線(xiàn)穿過(guò)剪開(kāi)處，距下腔靜脈約3mm處，分別環(huán)扎右葉根部剩余的左右側(cè)肝組織，將其切除。

供肝修整及離體肝葉切除剔除門(mén)靜脈、肝下下腔靜脈周?chē)亩嘤嘟M織后，分別套管（動(dòng)脈介入鞘管制成）。沿膈肌環(huán)切除膈肌，剪開(kāi)隔膜，在肝上下腔靜脈開(kāi)口左右側(cè)角處分別預(yù)置7－0Prolene線(xiàn)。離體切肝的60%PLT組，牽引固定預(yù)置縫線(xiàn)，減少供肝在冰浴中的滑動(dòng)；6－0Prolene線(xiàn)環(huán)扎切除尾葉；解剖分離左外葉韌帶，7－0Prolene線(xiàn)縫扎距門(mén)靜脈左外支蒂部遠(yuǎn)側(cè)約5mm處，縫扎范圍約5 mm，剪開(kāi)縫扎線(xiàn)遠(yuǎn)側(cè)約5mm范圍的肝組織，距左外葉蒂部約5mm處微血管鉗鉗夾剩余肝組織，沿鉗夾痕6－0Prolene線(xiàn)結(jié)扎切除左外葉。

受體手術(shù)術(shù)前30min肌注阿托品0．03mg，正中切口進(jìn)腹。順時(shí)針?lè)较蛞来渭糸_(kāi)鐮狀韌帶，縫扎左隔下靜脈，結(jié)扎肝食管交通支，游離肝下下腔靜脈，結(jié)扎右腎上腺靜脈，分離肝后韌帶至膈肌環(huán)，游離肝上下腔靜脈。解剖第一肝門(mén)，縫扎切斷肝動(dòng)脈，左右肝管分叉處結(jié)扎切斷膽總管，游離門(mén)靜脈至左右支分叉處。無(wú)創(chuàng)血管夾分別阻斷門(mén)靜脈和肝下下腔靜脈，停止吸入乙醚。在門(mén)靜脈左右支分叉處穿刺注射常溫乳酸林格氏液約2mL；去除肝臟內(nèi)血液并擴(kuò)容。7－0 Prolene線(xiàn)分別縫扎門(mén)靜脈左右支后，無(wú)創(chuàng)血管夾向兩側(cè)牽引縫線(xiàn)。Satinsky鉗阻斷肝上下腔靜脈，貼近肝臟剪斷肝上下腔靜脈，門(mén)靜脈左右支分叉處剪斷門(mén)靜脈，腎靜脈上方剪斷肝下下腔靜脈，移除肝臟。將供肝原位置入腹腔，表面予含0～4℃保存液的濕棉片保護(hù)。供肝預(yù)置縫線(xiàn)連續(xù)縫合肝上下腔靜脈的后壁、前壁。將供肝門(mén)靜脈套管置入受體門(mén)靜脈后環(huán)扎固定，開(kāi)放門(mén)脈血流，移除阻斷肝上下腔靜脈的Satinsky鉗。同法吻合肝下下腔靜脈。將膽道支架管插入受體膽總管，結(jié)扎固定。溫?zé)嵘睇}水沖洗腹腔，關(guān)腹前自陰莖背靜脈注射常溫生理鹽水2mL。

術(shù)后處理受體大鼠復(fù)溫至自主活動(dòng)后，放入單籠飼養(yǎng)。術(shù)后自由飲水，第2天起自由進(jìn)食。觀察一般狀態(tài)和存活情況，死亡病例均解剖確定死因。

結(jié) 果

肝葉切除后的供肝比例 在體切肝的60%PLT組，供肝與原肝重比為56．6%～62．9%，平均為59．7%；30%PLT組為29．5%～34．3%，平均為31．9%。離體切肝的60%PLT組，供肝與原肝重比為58．2%～64．5%，平均為61．2%。

各實(shí)驗(yàn)組的供肝比例均達(dá)到手術(shù)預(yù)期的60%和30%。

術(shù)后存活情況和死亡原因在體切肝的60%PLT組，1周存活率為88%，術(shù)后1天死亡1例，原因?yàn)楦沃腥~左側(cè)份壞死；術(shù)后2～7天死亡2例，原因分別為肝中葉左側(cè)份壞死（1例）和全中葉壞死（1例）。在體切肝的30%PLT組，1周存活率為64%，術(shù)后1天死亡3例，原因分別為肝斷面滲血（2例）和小肝綜合征（1例，表現(xiàn)為大量腹水、腸腔高度擴(kuò)張）；術(shù)后2～7天死亡6例，原因分別為肺炎（2例）和小肝綜合征（4例）。

離體切肝的60%PLT組，1周存活率為72%，術(shù)后1天死亡3例，原因分別為肝斷面滲血（1例）和肝中葉左側(cè)份壞死（2例）；術(shù)后2～7天死亡4例，原因分別為肝右葉壞死（1例）和肝中葉左側(cè)份壞死（3例）。

討 論

建立模擬臨床過(guò)程的動(dòng)物模型是進(jìn)行肝移植基礎(chǔ)研究的前提。作為理想的動(dòng)物模型，大鼠PLT術(shù)的關(guān)鍵在于獲取與臨床PLT比例相似的部分供肝。在臨床實(shí)踐中，PLT的比例常通過(guò)供肝體積與受體理想肝體積的比值來(lái)計(jì)算，30%為下限［10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)切除不同的肝葉組合所獲取的60%和30%比例供肝，與臨床PLT相似。

大鼠的肝臟分為左外葉、尾葉、中葉、右前葉和右后葉［5］，可以采取切除不同的肝葉組合來(lái)達(dá)到獲取不同比例部分供肝的目的。通過(guò)對(duì)大鼠肝臟解剖結(jié)構(gòu)的觀察，切除左外葉和尾葉可以獲取約60%比例的供肝；切除左外葉、尾葉、右葉、右前葉可以獲取約30%比例的供肝，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果吻合。鑒于部分移植術(shù)后的肝再生過(guò)程中可能發(fā)生的血管膽道扭轉(zhuǎn)的因素，本實(shí)驗(yàn)保留肝中葉的方法，可以避免上述并發(fā)癥的發(fā)生。在既往研究中，我們也通過(guò)切除左外葉、尾葉、肝中葉左側(cè)份獲取了50%比例的供肝；由于肝中葉較寬厚，且包繞下腔靜脈，切除左側(cè)份后，常發(fā)生肝斷面的滲血和膽漏，導(dǎo)致手術(shù)失敗和存活率較低。我們也曾嘗試通過(guò)僅保留肝中葉右側(cè)份作為供肝，來(lái)建立20%PLT模型，由于上述肝中葉解剖因素所致的并發(fā)癥及術(shù)后發(fā)生的小肝綜合征，此比例大鼠部分肝移植的成功率很低。

60%PLT組的死亡病例多見(jiàn)肝中葉左側(cè)份、甚至全中葉的壞死。通過(guò)解剖發(fā)現(xiàn)，大鼠門(mén)靜脈左外支進(jìn)入左外葉蒂部前，發(fā)出一側(cè)支進(jìn)入肝中葉左側(cè)份，因此保留這一側(cè)支對(duì)于保證肝中葉的血供尤為重要。在體切除左外葉時(shí)，門(mén)靜脈系統(tǒng)的顯露十分清晰，通過(guò)顯微操作在距蒂部約5mm處切除左外葉，可以避免大塊結(jié)扎造成殘余組織的過(guò)度收縮和擠壓，保證了肝中葉的血供，降低了受體大鼠的死亡率。由于左外葉切除后殘余蒂部的炎癥壞死可能累及門(mén)靜脈側(cè)支，所以仍有少數(shù)受體術(shù)后出現(xiàn)肝中葉壞死。我們采用相同的方法在大鼠肝切除模型中行左外葉切除，盡管術(shù)后也存在殘端炎癥，但無(wú)一例發(fā)生肝中葉壞死。我們推測(cè)這與移植模型的供肝僅有門(mén)脈性供血有關(guān)。離體切肝的60%PLT組術(shù)后出現(xiàn)了較多的肝中葉壞死，這可能由于離體切肝時(shí)縫扎、結(jié)扎的方向和力度不易掌控，容易造成殘余組織的擠壓變形；另外離體狀態(tài)下的門(mén)靜脈系統(tǒng)顯露較差，切肝時(shí)不能充分保護(hù)門(mén)靜脈，影響了供肝的血供。

30%PLT組中，很少發(fā)生肝中葉壞死，但小肝綜合征多見(jiàn)，主要表現(xiàn)為大量的腹水和腸腔的高度擴(kuò)張［9］，手術(shù)成功率和存活率明顯降低。作為小體積供肝，30%比例已接近PLT的下限［10］，其承受了更高的門(mén)靜脈壓力，比60%比例更能保證肝葉的血供，所以較少出現(xiàn)肝中葉壞死；然而門(mén)靜脈高壓又會(huì)加重移植物損傷，造成有效肝容量的進(jìn)一步減少，導(dǎo)致了小肝綜合征和移植物無(wú)功能的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)采用了在體和離體切肝兩種方式獲取部分供肝。在體切肝因能較為精準(zhǔn)地控制縫扎和結(jié)扎的范圍、力度和方向，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)肝斷面的滲漏情況，其手術(shù)成功和存活率較高；離體切肝時(shí)，若能注意上述操作細(xì)節(jié)，充分保護(hù)門(mén)靜脈血供，避免下腔靜脈的縮窄，也可取得較好的手術(shù)效果。由于保留了供肝獲取前的血供，在體切肝的方式與臨床活體肝移植相似；而在冰浴中的離體切肝，則能模擬臨床劈離式肝移植的過(guò)程。

我們?cè)诩韧芯康幕A(chǔ)上，通過(guò)在體切肝或者離體切肝的方式獲取部分供肝，分別建立了較為穩(wěn)定的60%和30%比例大鼠PLT模型，能較好地模擬臨床部分肝移植過(guò)程，為深入進(jìn)行肝移植的基礎(chǔ)研究提供了良好平臺(tái)。

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