天花粉蛋白（TCS）誘導腫瘤細胞凋亡及其抗腫瘤作用機制的研究進展

張 鐸（綜述） 陶 磊（審校） 路麗明

（復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院耳鼻喉科 上海 200031）

天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）是從葫蘆科植物栝蔞的塊根中提取出來的相對分子質量（Mr）為27 000的單鏈核糖體活性抑制蛋白（ribosome inactivating protein，RIP），TCS成熟肽由247個氨基酸殘基組成，PI為9．4［1］。臨床研究發現TCS具有多種藥理學活性，可用于治療宮外孕、絨毛膜上皮細胞癌、惡性葡萄胎等，對于宮頸癌及白血病等腫瘤也有不同程度的抑制作用［2］。體外研究表明TCS還具有抗病毒（如 HIV），激發調節性 T細胞（regulatory T cell，Treg）及協同進行免疫調節等功效［3－4］。

雖然TCS具有多種藥理活性，但其明確的作用機制尚未完全闡明。近年來，對TCS抗腫瘤的作用機制存在多種不同觀點，一種觀點認為，TCS作為RIP通過不可逆地抑制腫瘤細胞蛋白合成來抑制腫瘤生長；另有研究發現TCS可誘導某些腫瘤細胞凋亡［2－3］；還有研究表明TCS的抗腫瘤作用并非單一途徑，而是通過聯合作用于腫瘤組織而殺傷腫瘤細胞。研究發現，TCS的作用可能與其劑量有關，高劑量（＞100μg／mL）時，TCS可阻斷蛋白質合成；中等劑量（5～50μg／mL）時，TCS可誘導細胞凋亡；低劑量（＜1μg／mL）時，TCS可誘導免疫抑制［5］。本文就近年來TCS抗腫瘤作用機制的研究進展加以綜述。

TCS誘導腫瘤細胞凋亡凋亡又稱為細胞的程序性死亡（program cell death，PCD），近年來發現多種化療藥物可通過誘導細胞凋亡來發揮藥理作用［6］。在研究TCS抗腫瘤作用機制時發現TCS可誘導多種細胞凋亡。黃益玲等［7］研究發現，TCS能誘導人宮頸癌HeLa細胞中包括NOP56、TNFSF10、CASP9、DFFB等在內的62個與凋亡密切相關的基因表達上調；還能誘導包括COL9A3、MGST3、LGALS3BP等在內的16個與細胞黏附及細胞間相互作用相關的基因表達下調，但誘導凋亡的具體途徑和過程仍未闡明。

TCS通過依賴cAMP為第二信使的信號途徑來誘導細胞凋亡也有觀點認為TCS主要通過下調Bcl－2基因來誘導細胞凋亡。Bcl－2屬于抗凋亡基因，其表達增高可以維持線粒體內鈣穩態，阻止線粒體膜電位下降和線粒體膜通透性轉換孔的開放，抑制線粒體釋放促凋亡蛋白、Cyto－C和凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF），從而防止細胞凋亡。此外，Bcl－2能結合 Apaf－1和胱天蛋白酶－9（caspase－9），并維持其非活化狀態，阻止胱天蛋白酶級聯反應，防止細胞凋亡［8］。Wang等［3］研究發現利用環腺苷酸反應元件（cAMP response element，CRE）類似物阻斷cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element bound protein，CREB）作用于Bcl－2的基因位點，可以減弱TCS介導的Bcl－2基因表達下降。而p－CREB的過度表達可以上調Bcl－2的表達，在宮頸癌HeLa細胞中這一表達的上調可以被TCS治療所抑制。由此可以作出推斷，TCS誘導細胞凋亡可能是通過CREB介導來下調凋亡抑制基因Bcl－2的表達。另有研究發現，與傳統觀點認為cAMP激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、進而磷酸化CREB所不同，cAMP同樣可以激活PKC，后者作用于蛋白激酶ERK1／2和p38 MAPK，使之轉入細 胞核，磷酸化 CREB［9］。Li等［10］發現TCS誘導凋亡的機制可能通過PKC起作用，因為使用PKC激動劑會使TCS的作用下調；反之，應用PKC抑制劑會協同TCS的作用。［35S］GTPγS結合序列分析表明，TCS可以活化JAR細胞和K562細胞表面的G蛋白，進而通過G蛋白來調節腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC）的活性，Li等［11］研究發現TCS和高濃度的AC抑制劑都可通過劑量和時間依賴的方式來降低HeLa細胞內的cAMP水平，因此活化的抑制性G蛋白（Gi）參與了TCS誘導的凋亡。由此推測，TCS作用于抑制性Gi，抑制AC下調cAMP，從而抑制PKC活化，并通過p38MAPK和ERK1／2信號通路下調CREB磷酸化，下調Bcl－2等與凋亡抑制有關基因的表達，從而誘導凋亡。

TCS通過線粒體途徑誘導細胞凋亡TCS誘導凋亡的過程可以通過直接作用于線粒體而發生。Li等［12］研究發現，TCS可以誘導人前髓細胞HL－60發生凋亡，作用過程中發現TCS使線粒體膜的通透性發生改變，接著從線粒體到細胞胞質釋放細胞色素c和Smac，活化caspase－9，促進凋亡復合物的形成，進而通過線粒體途徑誘發細胞凋亡。同時發現，使用caspase－9抑制劑z－LEHD－FMK 時，細胞的凋亡進程被阻斷，說明caspase－9啟動的線粒體途徑參與到TCS誘導的凋亡［12］。此外，在研究TCS誘導細胞凋亡作用機制的過程中發現，使用Fas單克隆抗體不會阻止TCS誘導的細胞凋亡。由此證明，TCS不是通過死亡受體途徑，而是通過進入細胞內促發線粒體途徑而誘導細胞凋亡［11－12］。此外，一些學者通過形態學觀察揭示了TCS線粒體凋亡通路。研究TCS作用于視網膜時發現，TCS可以選擇性地進入并摧毀Müller細胞及色素上皮細胞，而對其他神經膠質細胞的作用輕微。TCS作用的視網膜細胞出現了核碎裂和核溶解，并出現了特征性的凋亡小體以及膨脹的線粒體。這些發現表明，TCS通過誘導細胞凋亡而發揮作用，而脹大的線粒體說明其凋亡過程可能依賴于線粒體［13］。

TCS通過影響細胞骨架來誘導細胞凋亡凋亡的主要形態學特征為表面微絨毛消失、細胞皺縮、胞質出泡形成凋亡小體。在核酸水平上，凋亡還可表現為核碎裂和核溶解。此外，凋亡還與細胞表達微管（microtubules，MT）、微絲（microfilaments，MF）的變化有關。Wang等［14］的研究還發現TCS誘導凋亡的過程中，解聚的MF在靠近細胞核和凋亡小體附近的粗糙細胞膜上堆積，緊接著在胞質膜下有MT形成環狀結構，由此可見TCS誘導的HeLa細胞凋亡和細胞重組高度協調。在生理條件下，MF維持質膜的完整性，凋亡過程中，MF解聚，MT對于維持質膜的完整起到了重要的作用，TCS誘導的細胞凋亡末期出現的環狀MT預示著細胞從凋亡向壞死過程的演進［11］。同時研究還發現，在TCS誘導細胞凋亡的過程中，肌動蛋白和微管蛋白基因受到了不同程度的調控——γ肌動蛋白mRNA下降速度快于β肌動蛋白，α和β微管蛋白mRNA在Hela細胞凋亡的晚期依次下調。這些結果都表明，TCS誘導的HeLa細胞凋亡伴隨著特殊的細胞骨架結構的改變，同時肌動蛋白和微管蛋白基因在細胞凋亡的不同階段表達受到抑制［14］。然而，TCS是否通過MF和MT影響細胞骨架來啟動細胞凋亡，還有待進一步研究探索。

TCS作為RIP發揮抗腫瘤作用RIP具有RNA N－C糖苷酶活性，能水解真核細胞核糖體28SrRNA的4324位上腺苷酸的N－C糖苷鍵，釋放出1個腺嘌呤堿基，使核糖體不可逆失活，從而抑制蛋白質合成。RIP可以分為2種類型：Ⅰ型RIP由單鏈組成，僅具有核糖體抑制活性，TCS是典型的Ⅰ型RIP；Ⅱ型RIP由2條多肽鏈組成，分別稱為A鏈和B鏈，A鏈從結構及功能上均與Ⅰ型RIP相似，B鏈具有凝集素樣結構，可特異地與真核細胞表面的半乳糖受體結合，有利于RIP進入細胞，其代表植物蛋白是蓖麻素蛋白（ricinus communis agglutinin，RCA）［15］。

TCS的選擇性作用機制Sha等［15］將RCA的A鏈與TCS對照研究時發現，體外TCS的毒性遠低于RCA；體內較小劑量的RCA就會引起壞死和炎癥，而TCS即使是較大劑量，也僅是引起視網膜細胞凋亡。Sha等［13］研究發現RCA毒性很強，對于哺乳動物細胞的殺傷幾乎不具有選擇性。相反，TCS通常具有選擇性，其毒性作用主要針對來源于滋養層細胞的絨毛膜癌及來源于骨髓造血干細胞的各種白血病，而對正常組織及其他組織的毒性較弱。TCS這一選擇性有利于其應用于臨床，而TCS選擇作用的機制可能與其進入細胞的途徑相關。

目前研究發現TCS可通過兩條途徑進入到細胞內而發揮細胞毒性作用：其一，通過TCS與磷脂膜相互作用進入細胞內；其二，通過受體介導的內吞作用，受體主要是低密度脂蛋白受體相關蛋白（lowdensity lipoprotein receptor related protein，LRP）［16］。Jiao等［17］研究發現，TCS通過絨毛膜細胞表面的JAR和BEWO細胞上的LRP1內吞進入到靶細胞內而發揮作用。而在HeLa細胞表面未發現LRP1，這可以解釋為什么HeLa細胞相比于JAR和BEWO細胞對TCS不敏感，可能是因為HeLa細胞不能通過有效的內吞途徑來攝取TCS。Li等［18］還發現，胃癌SGC－7901細胞相比于正常的胃黏膜上皮細胞對TCS更敏感；研究同時發現TCS誘導的細胞毒性在肝HepG2細胞上不如在JAR細胞上明顯，其機制可能也與LRP1介導的受體內吞有關。Zhao等［19］研究TCS抗HIV作用機制時發現，與RCA通過Sec61蛋白孔進入細胞內質網不同，TCS能直接穿過內質網膜。TCS通過膜表面的脂質進入，HIV－1包膜上存在大量脂質，因此可以確信TCS通過上述途徑進入HIV－1內發揮作用。TCS通過非特異性受體進入細胞發揮作用的研究解釋了TCS可特異性作用于腫瘤等靶細胞和靶組織，而對于正常組織和其他組織無作用。但仍存在一些疑問，如受體介導的內吞為什么可以躲過溶酶體的作用；一些正常的人體組織細胞表面有大量LRP1，但為什么對TCS同樣不敏感，這些問題有待于進一步研究探索。

TCS抑制蛋白質合成與其誘導細胞凋亡之間的關系早期認為TCS具有N－糖苷酶活性，可以阻斷蛋白質合成，后又發現其可誘導細胞凋亡。兩者之間是否存在相關性尚不明確［11］。在研究其他RIP誘發細胞凋亡機制的過程中發現，RIP的N－糖苷酶活性可以介導核糖體毒性應激反應（ribotoxic stress response，RSR），從而激活 SAPK／JKN 和p38信號通路，最終誘發細胞凋亡［20］。然而之前有研究報道，TCS 可以抑制 PKC／ERK1／2 和 p38 MAPK信號通路，導致HeLa細胞的生長抑制［9］。由此推斷，TCS可能并未參與RSR，也沒有通過N－糖苷酶活性來誘導細胞凋亡。在TCS誘導人前髓細胞HL－60發生凋亡的過程中，TCS處理1．5h后發生線粒體膜通透性改變，但其是否發生在蛋白質合成的抑制之前尚不明確［11］。

TCS的其他抗腫瘤作用機制最近研究發現TCS可以用于治療慢性髓細胞性白血病。慢性髓細胞性白血病的特征為染色體t（9；22）發生相互易位，稱為費城染色體。其中Bcr－Abl基因發生了融合，融合基因的轉錄和翻譯持續激活了原癌基因p210 Bcr－Abl，也導致了ABL酪氨酸激酶的活性失去控制。甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate，IM）是一種酪氨酸酶阻斷劑，也是治療慢性髓細胞性白血病最有效和最特異的藥物。然而臨床研究表明，IM不能完全清除惡性瘤變，而且長期使用的患者會對IM產生抵抗。TCS可以協同IM來誘導K562細胞生長停滯。這一作用可以理解為TCS抑制融合基因Bcr－Abl轉錄表達的酪氨酸激酶，并且下調原癌基因p210 Bcr－Abl水平，抑制如PKC和NF－κB等一些信號分子。而PKC和NF－κB廣泛參與細胞的增殖及其調控［21］。一些研究發現，使用NF－κB的抑制劑（如地塞米松）可以增強TCS誘導細胞凋亡的作用，由此推測NF－κB進入細胞核內可以上調一些抗凋亡基因（如Bcl－2）［18］。

此外，在研究TCS、米非司酮、順鉑在卵巢惡性腫瘤治療中的作用機制時發現，與順鉑和米非司酮不同，TCS的抗腫瘤作用機制之一是能夠明顯下調腫瘤組織中 HLA－G 和 HLA－E的表達水平。HLA－G和HLA－E是非經典HLA－Ⅰ分子，它們在腫瘤組織表面表達的上調可以抑制T細胞和NK細胞對于腫瘤組織的殺傷作用，從而使腫瘤組織逃過機體的免疫監視作用［22］。

結語TCS可以通過多種途徑來殺傷腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞生長，一方面可以發揮RIP活性，另一方面誘發腫瘤細胞的凋亡，此外還可以通過其他多種途徑來抑制腫瘤細胞的生長。然而，在TCS的研究過程中尚存在一些問題有待解決。例如，TCS發揮的RIP活性與其誘發腫瘤細胞凋亡之間的關系，如何通過對TCS的結構進行修飾來提高其生物活性并降低過敏原性，TCS誘導凋亡的通路等。相信隨著這些問題的解決，TCS可以更好地應用于臨床抗腫瘤的治療與研究。

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