uPA／PAI－1在乳腺癌中的表達及其臨床意義的研究進展

董 歡（綜述） 林燕蘋 應學翔 何萍青（審校）

（上海交通大學附屬第六人民醫院普外科 上海 200233）

目前，乳腺癌的發病率不斷升高，已經成為女性中最高發的惡性腫瘤之一，在過去的幾十年內系統性治療已使乳腺癌的死亡率大大降低，主要的致死原因是腫瘤的遠處轉移。腫瘤的轉移是一個多步驟參與的復雜過程，包括了腫瘤的局部浸潤、降解細胞外間質（extracellular matrix，ECM）、進入血液循環及在新的部位種植生存。傳統的預后指標如年齡、月經狀態、腫瘤大小、病理組織學分級、淋巴結狀態、激素受體情況和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER－2）狀態等并不能完全反映出宿主、腫瘤及環境的所有信息，由此來評價預后及制定治療方案可能有偏頗。因此，與腫瘤侵襲轉移有關的一些指標在不斷研究發展中，其中最主要的成員之一是尿激酶型纖溶酶原反應系統，這一系統包括了尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase－type plasminogen，uPA）及其受體（uPA receptor，uPAR）與纖溶酶原激活物抑制因子－1（plasminogen inhibitor 1，PAI－1）。隨著乳腺癌早期診斷水平的提高，淋巴結陰性患者的比例增高，這一反映乳腺癌侵襲指標的纖溶酶原反應系統的預后價值越來越凸顯，本文對uPA／PAI－1在乳腺癌中的表達及其臨床意義作一綜述。

uPA在乳腺癌浸潤轉移中的作用uPA是一種絲氨酸組蛋白酶，在正常細胞和腫瘤細胞均有表達，其最初的分泌形式為一種無酶活性的單鏈酶原，即纖溶酶原激活物前體（pro－uPA），pro－uPA通過纖溶酶的裂解作用成為活性形式uPA。uPA能夠將纖溶酶原轉化為有源矩陣絲氨酸組蛋白纖溶酶［1］，并通過蛋白水解作用降解腫瘤組織周圍多種上皮膜蛋白及基底膜成分；它同時也能活化多種生長因子，并促使上皮膜蛋白降解基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）。在腫瘤進展過程中，uPA、uPAR、PAl－1及 MMP相互作用，從而使得腫瘤細胞易于浸潤組織［1－2］。uPA和 MMP受到一系列的生長因子的調控，特別是表皮生長因子及其受體。研究發現，細胞外基質金屬蛋白酶誘導物（extracellular MMP inducer，EMMPRIN）是一種高度甲基化的免疫球蛋白家族成員，存在于腫瘤細胞及其間質的細胞膜表面，與惡性腫瘤進展相關［3］。Giusti等［4］的研究發現，一種表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的配體可以通過促進產生uPA而引起腫瘤細胞擴增。研究也顯示，多種實體瘤中都常見表皮生長因子受體信號通路激活，伴隨表皮生長因子受體增加，EMMPRIN在乳腺癌中的表達也明顯增加［5］。可能正是通過上調EMMPRIN在乳腺癌中的表達，EGFR增加了uPA和MMP的表達，從而使得腫瘤易于浸潤。

PAI－1在乳腺癌浸潤轉移中的作用纖溶酶原激活物抑制因子（plasminogen inhibitor，PAI）屬于絲氨酸蛋白酶抑制因子家族，目前已知有PAI－1、PAI－2、蛋白酶nexin和蛋白酶 C抑制劑（protein C inhibitor，PCI）4種。PAI－1和 PAI－2是uPA 的主要抑制物，但PAI－1的活性遠高于PAI－2，并且兩者與腫瘤預后的相關性也截然不同。PAI－1與細胞的移行、轉移及血管新生相關［6］，其高表達與腫瘤不良預后密切相關［7－9］。最新研究認為是PAI1特殊的分子結構使得它未能發揮抑制纖溶酶原激活物的作用［10］。PAI－1通過與uPA形成穩定的復合物，對纖溶酶原的形成產生負反饋抑制作用，PAI－1能夠誘導腫瘤細胞對復合物產生細胞內攝取作用，因而促進腫瘤細胞侵襲基底膜。PAI－1與整合素（integrin）、玻璃粘連蛋白（vitronectin，VN）、層粘連蛋白（laminin，LN）通過細胞內信號轉導途徑影響腫瘤細胞遷移及增殖。PAI－1／VN 復合物能使PAI－1具有抑制劑無關的功能。uPA－PAI－1復合物也可以通過與低密度脂蛋白（low density lipoprotein receptor，LDLR）家族的交互作用而間接地影響信號活性，更可以直接通過受體胞質區發出細胞信號［11］。PAI－1同樣可以刺激細胞發生不依賴uPA、組織纖維蛋白溶酶原激活（tissue plasminogen activator，tPA）和粘連蛋白的細胞移行。另一項研究也證明［12］，PAI－1和LDLR相互作用后，可間接導致刺激細胞JaK／STAT信號通路的活化，從而導致細胞移行的增加。

uPA／PAI－1表達對早期乳腺癌臨床預后的預測及化療、內分泌治療的指導作用對于乳腺癌患者，一些傳統的預后因素很重要，其中之一就是淋巴結狀態，它是評估早期乳腺癌危險分級最重要的因素。由于淋巴結狀態并不影響系統治療反應性，因此它只是純預后因素［13］。考慮到淋巴結陰性乳腺癌比例的升高和對潛在治愈患者過度治療現象的不斷出現，充分評估淋巴結陰性乳腺癌患者的復發風險特別重要。嚴格按照St．Gallen共識原則［14］，90%以上的淋巴結陰性乳腺癌患者將得到全身治療，雖然僅30%的患者將最終復發。在淋巴結陰性乳腺癌患者中，由uPA和PAI－1水平篩選出的低?；颊呒s占50%［9］，明顯高于前者，因此更接近局部治療可治愈的淋巴結陰性患者的實際比例（70%）。

歐洲癌癥研究組織（EORTC）對來自歐洲18個不同地區的8 377名早期乳腺癌患者中位隨訪6．5年的數據進行分析［15］，最重要的發現是uPA和PAI－1是僅次于淋巴結狀態的無病生存和總生存最可靠的預后因素。在包括所有預后因素（年齡、腫瘤大小、淋巴結累及情況、激素受體狀態和組織分級）以及輔助治療的多因素分析中，uPA和PAI－1仍是重要而可靠的危險因素。另外，并未發現其與激素受體狀態存在相關性，因此uPA和PAI－1不能預測內分泌治療的效果。再對其中未接受全身治療的3 362例淋巴結陰性的亞組分析后發現，uPA和PAI－1是最強有力的預后因素，有助于從這組人群中進一步區分出高或低復發風險的患者。

一項前瞻性多中心隨機臨床試驗Chemo N0納入556名淋巴結陰性乳腺癌患者，運用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定腫瘤組織中uPA和PAI－1水平，并以此對患者進行分組，uPA／PAI－1低水平患者的腫瘤復發風險相當低，即使不予全身治療，5年生存率也超過95%，10年生存率約為90%［9，16－17］。uPA／PAI－1表達高的患者隨機分成接受CMF方案化療組和觀察組，隨訪10年的結果顯示，CMF化療能降低一半的復發風險，結果也肯定了EORTC研究中所提示的uPA／PAI－1水平對化療療效的預測價值。這些結果均提示uPA／PAI－1作為反映腫瘤早期侵襲的指標是化療敏感性的標記物之一，從而有助于臨床上制定相關的化療方案。若采用現在較新的化療方案，則Chemo N0 10年生存曲線可能會更高。

同時，另一項回顧性研究［15］共入組3 424名早期乳腺癌患者，主要探索腫瘤組織uPA／PAI－1水平（ELISA方法）對化療和內分泌治療反應性的影響。經過83個月中位隨訪后，COX多因素生存分析顯示uPA／PAI－1與患者的無病生存率顯著相關（P＜0．001，HR＝2．0，95%CI為1．8～2．3）。uPA／PAI－1高水平患者比低水平患者從輔助化療中獲益更多，這個發現與Chemo N0試驗中高?；颊邚腃MF化療更大獲益的結論一致。無論從總體還是淋巴結亞組分析上看，化療效果和uPA／PAI－1水平有明顯相關性（P＜0．003，HR＝0．68，95%CI為0．53～0．88）。另外，該研究并未發現內分泌治療與uPA／PAI－1水平存在顯著相關性，uPA／PAI－1水平的高低與內分泌治療獲益并未見明顯差異。而其他有關于晚期乳腺癌的研究則提示高表達uPA、uPAR及PAI－1的腫瘤對一線三苯氧胺治療的反應性較差，從而降低了無進展生存率［18］。這一結果提示我們對尿激酶系統指標的測定有助于從激素受體陽性乳腺癌患者中區分出高危患者，從而采取更為積極的治療，有助于提高生存率。

uPA／PAI－1水平在臨床上為我們提供了腫瘤患者復發風險和治療反應的參考水準，幫助我們調整乳腺癌患者全身治療的概念，即根據個體腫瘤生物學特點選擇治療方案。

2005年，國際早期乳腺癌試驗者協作組（the Early Breast Cancer Trialists′ Collaborative Group，EBCTCG）提出：除內分泌治療的效果外，包括蒽環類的化療方案能使早期乳腺癌15年累計死亡率減少38%（絕經后）和20%（絕經前）［19］。后來一項病例對照研究［20］論證了包括蒽環類的化療比CMF對uPA／PAI－1高表達乳腺癌效果更好，而對uPA／PAI－1低表達乳腺癌來說療效沒有明顯區別。當然，該試驗樣本量較小且存在交互因素的影響，其結論尚需要其他大樣本前瞻性試驗的驗證。

綜上所述，大量回顧性和前瞻性研究都表明uPA／PAl－1能預測淋巴結陰性乳腺癌高復發風險，且能從全身化療中明顯獲益。因此，在美國臨床腫瘤學 會 （American Society of Clinical Oncology，ASCO）的乳腺癌腫瘤標記物應用指南更新版（2007年）中將uPA／PAI－1列入是乳腺癌患者新的預后指標［21］。最新的一項隨機臨床試驗 NNBC3（Node Negative Breast Cancer 3－Europe）試 圖 闡 述 以uPA／PAI－1和／或臨床病理因素定義的高低危復發患者對含紫衫類化療的療效［22］。該試驗目前已完成入組，2 661名患者歸為高危組并得到及時化療，其中1 334名高?；颊呤褂?周期FE100C序貫3周期多西紫杉醇，1327名高?；颊呤褂?周期FE100 C。主要終點事件是無病生存（disease－free survival，DFS），次要終點 事件是 總 生存 （overall survival，OS）。該試驗結果將有助于我們進一步從淋巴結陰性患者中區分出高復發風險的患者，并采用可能更為有效的化療方案。

uPA系統在乳腺癌靶向治療中的研究進展

由于uPA系統參與了腫瘤侵襲、轉移、細胞增殖及血管生成等乳腺癌發展的各個方面，加之所涉及的細胞因子多，作用機制復雜，使得將uPA作為靶點治療乳腺癌成為目前的研究熱點。目前探討較多的有DNA甲基化、RNA干擾、與uPA抑制相關的細胞因子等。

關于DNA甲基化的研究，主要是基于乳腺癌中uPA基因的表達與其非甲基化狀態存在緊密聯系這一理論基礎。DNA甲基轉移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）可導致uPA 基因的甲基化及沉默，且抑制浸潤性乳腺癌細胞的轉移。Pakneshan等［23］將RAS基因轉染入乳腺癌細胞MDA－MB－231中，結果發現DNMTl表達被激活，而uPA基因的表達及其活性被抑制，進而使癌細胞的侵襲能力被削弱。由此看出，在很多癌癥中刺激腫瘤生長的RAS－DNMT1DNA甲基化路徑卻對高侵襲乳癌細胞MDAMB231的侵襲力產生了抑制的作用［23］。通過這一機制，在接下來的研究中直接應用S－腺苷－L－蛋氨酸（AdoMet，具有超甲基化及抑制去甲基化作用）處理MDA－MB－231細胞，同樣發現癌細胞的uPA表達及侵襲能力明顯下降，在動物模型中則表現為腫瘤生長及轉移受到抑制，從而也揭示了一條乳腺癌的治療途徑［24］。AdoMet對uPA表達的抑制作用可被去甲基藥物5－氮雜胞苷逆轉，在Ateeq等［25］的實驗中也證實了臨床用抗癌藥5－氮雜2′－脫氧胞苷（5－aza－CdR）在抑制乳腺癌細胞增殖的同時，還誘導了uPA、趨化因子受體（CXC chemokine receptor4，CXCR4）及轉 化 生 長 因 子（transfor－ming growth factorβ，TGF－β）等腫瘤轉移基因的表達。

RNA干擾是抗腫瘤研究中的一種常用手段。RAS－細 胞 外 信 號 調 節 激 酶 （extracellular signal regulated kinase，ERK）信號通路的激活 有賴于uPA與uPAR之間的結合，因此uPA與uPAR的RNA干擾不僅抑制uPA和uPAR的表達，同時也抑制了癌細胞增殖［26］。而 Kunigal等［27］則利用pUM（uPA與 MMP－9共同的小干擾RNA質粒載體）轉染兩種乳腺癌細胞 MDA－MB－231和ZR－75－1，致使uPA 和 MMP－9的表達同時下調，同時MAPK、ERK和AKT（絲裂原活化蛋白激酶、ERK、蛋白激酶B）信號通路分子的磷酸化水平受到抑制，其結果是癌細胞的侵襲及遷移能力明顯減弱，細胞增殖降低，動物轉移瘤的血管生成減少，甚至完全抑制了裸鼠的原位乳腺癌。目前已有數種RNA干擾藥物（如 Bevasiranib、sirna－027）進入臨床試驗。2008年11月，Wyszko等［28］則報道了第一個應用RNA干擾技術治療腫瘤（神經膠質瘤）的臨床試驗，為這項技術應用于臨床提供了先例。

近年來發現多種在正常乳腺組織中表達且與uPA抑制相關的細胞因子。乳腺癌轉移抑制因子－1可通過抑制核因子－kappaB（NF－κB）的活性，下調uPA乳腺癌細胞中的表達［29］。Maspin是一種特殊的絲氨酸蛋白酶抑制劑，實驗證實乳腺癌細胞MDA－MB－231中的 Maspin能下調uPA／uPAR的表達以及uPA的活性，從而減弱其侵襲能力［30］。酪氨酸激酶（Sky）與白細胞特異性激酶（Lck）之間的反應抑制了小鼠中乳腺癌細胞的uPA、MMP－9及VEGF的表達，對乳腺癌的進展有負向調節作用［31］。以上幾種細胞因子均在正常乳腺組織中表達，但在乳腺癌組織中沉默，通過對其表達水平的上調，可能發現有效的治療途徑。

結語眾多研究表明uPA／PAI－1的過度表達與早期乳腺癌患者的臨床預后較差有關，這些研究提示應用這兩個因素進行分析，能提示2～8倍的復發和死亡風險［32－33］。更重要的是在淋巴結陰性患者中，這兩個指標是獨立的預后因素，有助于輔助治療方案的制定。隨著臨床上淋巴結陰性患者的比例逐漸升高，uPA／PAI－1狀態判定越來凸顯其重要性，一方面讓我們更為精準地治療那些真正需要通過輔助治療提高生存率的患者，另一方面對乳腺癌早期侵襲的靶點治療研究也提供了治療失敗后的另一個有效方法。靶向治療的機制主要是干擾uPA系統，抑制uPA／PAI－1的同時抑制乳腺癌的侵襲及轉移。對于uPA／PAI－1高表達的早期乳腺癌或許可以聯合化療和靶向治療，當然，尚需大量前瞻性研究探索最佳化療方案，何種化療方案最適合與靶向治療聯用，以及與何種靶向治療方案連用才能獲得較大的獲益，同時使不良反應降到最小。

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