HPLC 法測定骨質(zhì)增生散中補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素的含量

朱艷紅 包長龍

內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 通遼 028000

骨質(zhì)增生散是由白花蛇舌草、烏梢蛇、補(bǔ)骨脂、乳香、沒藥、槲寄生、西紅花、熟地黃、杜仲、牛膝十味藥組成的復(fù)方制劑。功能主治為各部位骨質(zhì)增生。補(bǔ)骨脂為該方中主要成份［1］之一，具有溫腎助陽、腰膝冷痛、腎虛作喘功效。對本方的臨床療效有重要作用，以補(bǔ)骨脂中主要有效成分補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素為定量監(jiān)控指標(biāo)可有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。本文采用HPLC法測定其中補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素的含量，方法簡單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。可作為質(zhì)量控制的方法。

1 儀器與試劑

島津LC－10AT高效液相色譜儀，SPD－10Avp檢測器、SIL－HTA自動進(jìn)樣器、CLASS－VP工作站組成。甲醇為色譜純，水為高純水。補(bǔ)骨脂素 (中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用。批號:110739－200613)與異補(bǔ)骨脂素 (中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用。批號:110738－200309)。骨質(zhì)增生散 (批號:20070608、20081003、20091002)由通遼市科左中旗蒙醫(yī)院制劑室提供。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18柱 (250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇－水 (45:55)，柱溫:40℃，檢測波長為206nm，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù):按補(bǔ)骨脂素峰計算應(yīng)不低于3000，補(bǔ)骨脂素峰與異補(bǔ)骨脂素峰與相鄰色譜峰的分離度大于2.5。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對照品適量，加甲醇制成每 1ml分別含 0.02015mg、0.02114mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液 取骨質(zhì)增生散粉末約1.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理 (功率300W，頻率50kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 按照處方比例并以相同工藝制備缺補(bǔ)骨脂的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，結(jié)果:陰性對照溶液色譜中，在與補(bǔ)骨脂素對照品與異補(bǔ)骨脂素對照品以及供試品色譜圖相對應(yīng)的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)。故認(rèn)為陰性對照無干擾，色譜圖見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液2、6、8、10、15、20、30μL分別進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo) (Y)，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) (X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量在0.02442～0.36624μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。異補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量在0.02808～0.4212μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。回歸方程分別為:

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下的對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，補(bǔ)骨脂素色譜峰面積的RSD(n=6)為1.5%。異補(bǔ)骨脂素色譜峰面積的RSD(n=6)為1.3%。

圖1 HPLC色譜圖

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析測定。結(jié)果補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素含量和的平均值 (n=6)為0.47mg·g－1，RSD為1.5%。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8，12，24h按上述色譜條件測定。測得補(bǔ)骨脂素的平均峰面積為848530，RSD(n=6)為1.3%;異補(bǔ)骨脂素平均峰面積為790053，RSD(n=6)為1.2%。結(jié)果表明供試品溶液室溫放置24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品約0.7g，共6份，分別精密加入補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素對照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測定含量，并計算回收率。結(jié)果見表1。補(bǔ)骨脂素平均回收率 (n=6)為100.3%。異補(bǔ)骨脂素平均回收率 (n=6)為102.5%。

2.11 樣品測定

取骨質(zhì)增生散，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計算含量。結(jié)果見表2。

表1 骨質(zhì)增生散中補(bǔ)骨脂素的回收率

表2 骨質(zhì)增生散中異補(bǔ)骨脂素的回收率

表3 骨質(zhì)增生散中補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素的含量和測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 測定波長的選擇

配制一定濃度的補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素對照品溶液，分別在200～500nm波長內(nèi)進(jìn)行全掃描，補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素在206nm處均有較強(qiáng)的紫外吸收。實(shí)驗(yàn)選擇206nm進(jìn)行測定。

3.2 提取方法的考察

根據(jù)補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素性質(zhì)，結(jié)合本品劑型的特點(diǎn)曾先后采用取本品加甲醇超聲30分鐘、40分鐘、50分鐘，及加甲醇索氏提取2小時的方法提取供試品，供試品含量測定結(jié)果基本相同，前一種提取方法簡便省時，故選定加甲醇超聲30分鐘制備供試品溶液。

3.3 據(jù)文獻(xiàn)［2－6］采取補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素含量的和作為補(bǔ)骨脂藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，故本研究也采用兩組分的和來做質(zhì)量研究。

3.4 本文建立了一種準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)、簡單快捷的定量方法，通過對補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量測定，達(dá)到控制該制劑質(zhì)量的目的。

［1］蘇子仁，徐必達(dá)，劉慶思.補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在骨康提取精制過程中化學(xué)轉(zhuǎn)化的研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，1997，3(6):1.

［2］陸蓓，吳韶銘.HPLC法測定益腎靈顆粒中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2002，3(4):23.

［3］王錦紅，孫傳梅.高效液相色譜法測定長壽長樂補(bǔ)酒中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量［J］.中國藥業(yè)，2006，15(11):42.

［4］李學(xué)松，范興東.補(bǔ)腎益腦膠囊中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測定［J］.中成藥，2006，28(6):810.

［5］常新全，丁麗霞.中藥活性成分析手冊［M］.學(xué)苑出版社，2002:1120－1120.

［6］中國藥典［S］.一部，2010:174－174.