開竅醒腦顆粒對(duì)缺血性腦卒中模型大鼠炎癥因子的影響

王舒舒，龍子江，陳 明，劉金林，司文文，祝 浩

（安徽中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽合肥230038）

腦血管病是第一位的致殘?jiān)蚝偷诙坏闹滤涝颍?］。隨著現(xiàn)代科學(xué)及診療技術(shù)的進(jìn)步，人們對(duì)中風(fēng)病因病機(jī)的研究有了更進(jìn)一步的發(fā)展。本課題研究的開竅醒腦顆粒，是一種中藥復(fù)方制劑，旨在通過觀察開竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠的預(yù)防保護(hù)作用，考察其治療效果，探究其可能的作用機(jī)制，充分發(fā)揮中醫(yī)藥多途徑、多層次、多靶點(diǎn)的綜合治療效果的特點(diǎn)，以期達(dá)到對(duì)腦卒中更好的防治效果［2］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠120只，雌雄各半，體重240 g～260 g。由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證：SCXK（蘇）2007-0004。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 受試藥物：開竅醒腦顆粒（安徽中醫(yī)學(xué)院藥理教研室）；陽性藥物：華佗再造丸（廣州奇星藥業(yè)有限公司，批號(hào)：9350）；血栓誘導(dǎo)劑：凝血酶（SIGMA，批號(hào)：T-4648）；甲醛溶液（上海溶劑廠，批號(hào)：98019）；枸櫞酸鈉（上海星火制藥廠，批號(hào)：50301）；水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：T20060331）；IL-1β ELISA 試劑盒、IL-6 ELISA 試劑盒、TNF-αELISA試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：XS201009241、XS201009654、XS201009498）；其余普通試劑由安徽中醫(yī)學(xué)院藥理教研室提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 800型電動(dòng)離心機(jī)：江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；電子太平：上海天平儀器廠；Anke TDL-5臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；精密電子天平：日本AND益R-12。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 取120只SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性對(duì)照組（華佗再造丸，0.72 g/kg）、開竅醒腦顆粒低（1.08 g/kg）、中（2.16 g/kg）、高（4.32 g/kg）劑量組。各組大鼠按照上述劑量連續(xù)灌胃給藥7 d（1 mL/100 g體重），每天1次，假手術(shù)組及模型組給予等容量的生理鹽水。末次給藥后40 min，按照上述方法制備大鼠實(shí)驗(yàn)性腦卒中模型，次日繼續(xù)給藥［3］。

1.2.2 模型制備方法 大鼠禁食12 h，末次給藥后40 min，用3.4%水合氯醛以1 mL/100 g體重的劑量腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。頸正中部縱向切開皮膚，切口長約2 cm，游離出右側(cè)頸總動(dòng)脈，從頸總動(dòng)脈分叉處向上分離頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈，然后向顱底方向分離頸內(nèi)動(dòng)脈，在顱底處分離出翼腭動(dòng)脈，并結(jié)扎其根部，僅保留頸內(nèi)動(dòng)脈入顱底主干；結(jié)扎頸總動(dòng)脈，暫用2只微型動(dòng)脈夾間隔一定距離夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在近心端頸總動(dòng)脈處用眼科剪剪一小口，插入導(dǎo)管（內(nèi)已抽好血栓誘導(dǎo)劑凝血酶10 μL加生理鹽水0.05 mL）固定后，移去近導(dǎo)管端血管夾，少量血液流入導(dǎo)管頭端，放置約10 min形成一小血栓；然后移去另一只血管夾，緩慢將此血栓和凝血酶注入頸內(nèi)動(dòng)脈后，拔出導(dǎo)管，并將頸總動(dòng)脈切口處結(jié)扎，縫合切口；術(shù)后單籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組手術(shù)操作過程同上，只是不注入血栓和凝血酶，而注入等量生理鹽水。

1.2.3 組織取材及檢測指標(biāo) 術(shù)后24 h，用水合氯醛腹腔注射（3.4%，1 mL/100 g體重）麻醉，仰臥位固定，取各鼠腦組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.2.4 組織形態(tài)學(xué)觀察 每組隨機(jī)取10只動(dòng)物，處死并立即在冰盤內(nèi)開顱取腦，將腦組織置于10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，置于光鏡下，觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：（-）無病變 0 分；（+）輕度病變 1 分；（++）中度病變2分；（+++）重度病變3分。

1.2.5 腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量測定 取剩余10只大鼠新鮮的腦組織，稱重后放入盛有PBS的試管中，保存在-80℃冰箱備用。取保存在-80℃冰箱中腦組織塊，凍融后用冷生理鹽水沖洗，然后用濾紙吸干，放入玻璃勻漿器加入少量的生理鹽水（0.5 mL～1.0 mL），上下轉(zhuǎn)動(dòng)碾磨數(shù)十次使組織勻漿化。最后再加適量生理鹽水配成30 g/L腦組織勻漿，將勻漿以4000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法檢測IL-6、IL-1β、TNF-α水平，按試劑盒使用說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 開竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠腦組織形態(tài)學(xué)影響

結(jié)果見表1、圖1。

表1 開竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠腦組織病理變化的影響 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P<0.01；與模型組比較，2）P<0.05，3）P<0.01

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圖1 開竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠腦組織形態(tài)學(xué)影響病理照片

由表1可見，與假手術(shù)組比較，腦卒中模型組大鼠腦組織水腫、膠質(zhì)腫脹以及炎細(xì)胞浸潤程度顯著增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01），說明模型組大鼠腦損傷嚴(yán)重；開竅醒腦顆粒高、中、低劑量組與模型組比較，腦組織各種病變顯著緩解（P<0.05，P<0.01），能顯著降低中風(fēng)大鼠腦損傷程度，對(duì)大鼠血栓導(dǎo)致的中風(fēng)損傷有保護(hù)作用，并隨劑量增加作用增強(qiáng)。

鏡下病理觀察可見：大鼠腦血栓形成后，鏡下觀察假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元分布規(guī)則，數(shù)量正常，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不腫脹，腦組織除個(gè)別有輕度充血外其余均無充血水腫。模型組可見大小不等梗死灶形成，梗死灶形態(tài)不規(guī)則，梗死灶區(qū)神經(jīng)元大多數(shù)變性壞死或消失，膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，體積增大，腦組織充血水腫，邊緣區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤。陽性藥物組及開竅醒腦顆粒高、中、低劑量組少數(shù)仍有梗死灶發(fā)生，但面積較小，多數(shù)不發(fā)生梗死，神經(jīng)元分布及數(shù)量也基本正常，膠質(zhì)細(xì)胞腫脹也不明顯，腦組織充血水腫很輕，炎細(xì)胞浸潤較不明顯。

2.2 開竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α 含量的影響

結(jié)果見表2。

表2 開竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響 （±s，ng/L）

表2 開竅醒腦顆粒對(duì)腦卒中模型大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響 （±s，ng/L）

注：與假手術(shù)組比較，1）P<0.05，2）P<0.01；與模型組比較，3）P<0.05，4）P<0.01

組別 n I L-1 β T N F-α I L-6假手術(shù)組 60.3860±0.0687 0.3468±0.0269 0.6838±0.0651模型組 60.4702±0.0222 1） 0.4340±0.0265 2） 0.7820±0.0387 1）陽性對(duì)照組 60.4083±0.0046 4） 0.3645±0.0332 4） 0.5113±0.0369高劑量組 60.4112±0.0089 4） 0.3657±0.1889 4） 0.4694±0.0497 4）中劑量組 60.4217±0.0116 4） 0.3788±0.0225 4） 0.4058±0.0144 3）低劑量組 60.4315±0.0069 4） 0.3962±0.0147 3） 0.3713±0.0531 4）

由表2可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TNF-α、IL-1β含量明顯增高，IL-6含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，開竅醒腦顆粒高、中、低劑量組腦組織中TNF-α和IL-1β含量明顯降低，IL-6含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中后血腫內(nèi)和血腫周圍存在明顯的炎癥反應(yīng)，并表達(dá)多種細(xì)胞因子，主要包括白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和核因子-κB（NF-κB）等［4］。這些細(xì)胞因子在腦卒中后腦損傷的病理過程中扮演著重要角色［5］。①TNF-α是體內(nèi)最主要的炎性介質(zhì)之一，是具有多效性作用的促炎性細(xì)胞因子［6］。腦卒中炎癥反應(yīng)的核心是TNF-α在血液中的激活。TNF－α在腦炎癥活動(dòng)中起著重要的作用，它能影響血管內(nèi)皮細(xì)胞活性并對(duì)血管炎性過程起到調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)細(xì)胞黏附因子在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，引起白細(xì)胞黏附、聚集并從毛細(xì)血管遷移至腦，從而對(duì)繼發(fā)性腦損傷起到關(guān)鍵的促發(fā)作用，導(dǎo)致腦血栓以及炎癥反應(yīng)的加重［7］。②IL-1β是炎癥細(xì)胞的強(qiáng)烈趨化因子，是血漿和組織液中的主要分泌形式，也是腦組織中的主要形式，參與周圍免疫反應(yīng)。IL-1β能夠協(xié)同其他細(xì)胞因子活化B、T細(xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，誘導(dǎo)和促進(jìn)腦缺血后炎癥介質(zhì)對(duì)腦組織的損傷，損傷神經(jīng)元［8］。③IL-6被視為一種與中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血相關(guān)的重要炎癥反應(yīng)分子。通常情況下，正常血漿中含有的IL-6量很少，只有在炎癥、感染和患有某些腫瘤等情況下，IL-6的含量會(huì)上升。IL-6與IL-6R形成復(fù)合物后，就可作用于表達(dá)模型gp130分子的細(xì)胞，引起生物學(xué)效應(yīng)［9］。IL-6可以抑制IL-1和TNF-α的合成，并能刺激產(chǎn)生它們各自的循環(huán)拮抗劑-可溶性腫瘤壞死因子-α受體（sTNF-αR）和白介素-1受體拮抗劑（IL-1RA），從而對(duì)抗IL-1和TNF-α所致的炎癥損傷。因此IL-6在腦缺血急性反應(yīng)期發(fā)揮了重要的抗炎作用。開竅醒腦顆粒可升高IL-6含量，保護(hù)腦組織，其作用機(jī)制有可能在于促進(jìn) IL-6 對(duì)抗 TNF-α、IL-1β 等其他炎癥因子［10］。

腦血栓形成后，血液中包含的大量炎癥因子流到腦組織，進(jìn)一步加重腦血栓后的損傷［11］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，開竅醒腦顆粒對(duì)腦血栓引起的中風(fēng)形成的炎癥因子有抑制作用，通過降低炎癥因子的含量，進(jìn)而抑制級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生等機(jī)制來保護(hù)腦組織。這就進(jìn)一步驗(yàn)證近年來從炎癥角度出發(fā)對(duì)血栓性中風(fēng)疾病的研究是有現(xiàn)實(shí)意義的，同時(shí)為臨床中藥治療腦缺血病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

腦血栓是腦血管病中的急重癥，屬中醫(yī)學(xué)中風(fēng)、卒中范疇。自《黃帝內(nèi)經(jīng)》后，歷代醫(yī)家對(duì)其病機(jī)進(jìn)行了完善，多認(rèn)為陰虛血瘀、氣虛血滯是導(dǎo)致腦血栓的始動(dòng)因素。因此，破血逐瘀是腦血栓的基本治法。開竅醒腦顆粒為中藥復(fù)方制劑，由水蛭、人參、郁金、石菖蒲、桂枝、人工牛黃等組成。方中水蛭破血、逐瘀、通經(jīng)；人參大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺；郁金活血止痛、行氣解郁、清心涼血、疏肝利膽。幾味藥合用共奏破血逐瘀、息風(fēng)開竅之功。現(xiàn)代藥理研究表明，水蛭具有抗凝、抗血栓、保護(hù)缺血再灌注損傷、降壓、降脂及改善血流變等作用；人參皂苷可加快脂質(zhì)代謝，行了正交優(yōu)化研究，采用L9（33）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3的極差分析可知，3種因素的最佳組合為A2B3C2。從表3計(jì)算的K值可以知道，最佳水平組合為A3B3C3，因此用A3B3C3做驗(yàn)證性試驗(yàn)，即浸提溫度90℃、料液比 1∶40、浸提時(shí)間 2.5 h，試驗(yàn)結(jié)果為聚合草提取液中黃酮類物質(zhì)含量是3.01%。所以最終確定最佳的提取工藝條件為A3B3C3。

3 討 論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定聚合草黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)為：浸提溫度90℃、料液比1∶40、浸提時(shí)間2.5 h，在此提取工藝條件下聚合草提取液中黃酮類物質(zhì)含量為3.01%。且該方法設(shè)備簡單，操作簡便，是一種較為理想的提取方法。不僅黃酮含量高，像蛋白質(zhì)和多糖等其他物質(zhì)含量也很高。在今后的開發(fā)利用過程中，我們可以嘗試對(duì)該草中的各種物質(zhì)進(jìn)行提取做一些保健和美容的產(chǎn)品。

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