黃芩素對大鼠腎間質纖維化的干預作用及對腎組織中TGF-β1和Smad-2表達的影響

王文玉，郭 孜，孫淑軍，戴建業，曹慧娟，鄭寧寧，房軍偉，茍小軍，陸 雄，張永煜*

(1.上海中醫藥大學中醫方證與系統生物學研究中心，上海 201203；2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院 肝病所，上海 201203；3.上海中醫藥大學科技實驗中心 光鏡室，上海 201203)

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血安胎等功效。已有研究[1-3]報道，黃芩及黃芩提取物具有抗肝、肺纖維化的作用，黃芩總苷元提取物對于氯化汞所致大鼠腎纖維化也具有一定改善作用[4]。目前臨床上尚無專門治療腎纖維化的藥物,而研究表明黃芩及其提取物有一定抗纖維化的作用。本研究主要觀察黃芩素對單側輸尿管結扎(Unilateral Ureteral Obstruction,UUO)所致大鼠腎纖維化的干預作用，并利用免疫組織化學技術對腎組織中TGF-β1和Smad-2表達的影響進行研究，以期尋找一種治療腎纖維化的有效物質。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 黃芩素(陜西慈緣生物技術有限公司，98%)，科素亞(杭州默沙東制藥有限公司)，羥脯氨酸試劑盒，單克隆小鼠TGF-β1抗體，多克隆兔Smad-2抗體，SABC試劑盒(SA1022，兔IgG-KIT)，SABC試劑盒(SA1021，小鼠IgG-1/2KIT)，DAB顯色試劑盒，蘇木素染液，磷酸鹽PBS緩沖液(pH 7.4～7.6)，檸檬酸鹽緩沖液，中性樹膠，二甲苯。

1.2 動物及分組 SD雄性大鼠，體質量(160±10)g,由復旦大學實驗動物中心提供,40只，適應性飼養1周后隨機分為5組，每組8只：假手術組、模型組、科素亞(陽性藥)治療組20 mg/(kg·d)、黃芩素高劑量組200 mg/(kg·d)、黃芩素低劑量組100 mg/(kg·d)。

2 實驗方法

2.1 動物造模及處理 除假手術組外,其他4組行單側輸尿管結扎。手術當天給藥，分別灌胃10 d,假手術組和模型組以等容積的0.5%CMC-Na代替。處死大鼠前1 d收集24 h尿液并記錄尿量。大鼠腹腔注射麻醉后仰臥位固定，經腹主動脈采血，分離血清。摘取左側腎臟，留取部分用10%福爾馬林固定，部分用于羥脯氨酸含量測定。

2.2 生化指標測定 將所分離的血清及尿液各取100 μL,分別按各個檢測指標說明書的操作方法，測定血清Scr，BUN，尿液Cr，腎臟組織Hyp含量，并計算內生肌酐清除率。

2.3 組織病理學觀察 將10%福爾馬林固定后的腎臟組織石蠟包埋,行HE和天狼星紅染色，光鏡觀察其病理改變。

2.4 免疫組化觀察腎組織TGF-β1、Smad-2表達 采用SABC法,按試劑盒說明進行操作。

3 結果

3.1 對大鼠腎功能的影響 見表1。

3.2 對大鼠腎組織Hyp含量的影響 見表2。

表1 對大鼠腎功能Scr、BUN、內生肌酐清除率的影響(±s)

表2 對大鼠腎組織Hyp含量的影響(±s)

3.3 組織病理學觀察 見圖1，圖2。

HE染色見圖1，假手術組結構正常，腎間質無改變，腎小管上皮細胞排列整齊,細胞結構完整，小管與小管之間間隙緊密，小管間質無炎性細胞浸潤；模型組大量腎小管上皮細胞腫脹、脫落壞死、部分腎小管明顯萎縮、部分腎小管明顯擴張，炎癥細胞浸潤；科素亞組見少量的炎性細胞浸潤以及纖維組織增生，腎小管輕度擴張，部分腎小球輕度萎縮，腎小囊擴張，但還保留著一部分正常的小管和小球結構；黃芩素治療組腎臟炎性細胞浸潤及間質損傷輕于同期模型組。

天狼星紅染色見圖2,假手術組可見腎小管間質染色較少；模型組可見腎小管擴張，腎間質明顯增寬，膠原大量沉積，尤以髓質明顯；科素亞組、黃芩素治療組較模型組，腎纖維化程度明顯降低。

3.4 對各組大鼠腎組織中TGF-β1和Smad-2表達的影響 見表3。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1和Smad-2含量的比較(±s)

4 討論

腎間質纖維化幾乎是所有腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同病理途徑。臨床上，輸尿管梗阻是導致腎間質纖維化最終至腎衰竭的常見原因之一。

本實驗研究中，在手術后第10天，模型組大鼠梗阻側腎臟顯著增大腫脹，嚴重出現積水，包膜顯著增厚，科素亞治療組較模型組大鼠腫脹及積水情況減輕，且包膜較薄，黃芩素治療組梗阻側腎臟腫大及積水程度較輕，色澤較紅潤，說明各治療組均可以改善梗阻側腎臟積水及腫脹程度。在UUO造模第10天時,模型組大鼠血肌酐(Scr)、血清尿素氮(BUN)和腎組織羥脯氨酸含量(Hyp)均高于假手術組，內生肌酐清除率(Ccr)明顯低于假手術組，提示已造成腎臟損傷。光鏡下觀察到模型組已出現纖維化，而各給藥組對纖維化有改善作用。

綜上所述，黃芩素可明顯改善梗阻側腎臟的腫脹及積水情況，在生化指標方面可改善大鼠血清腎功能，在病理形態學方面可明顯減輕腎小管間質的損傷程度、間質纖維化程度及淋巴單核細胞的浸潤情況。近年的研究發現，腎纖維化的發生發展過程由多種因素參與，涉及多種細胞因子、生長因子和細胞外基質的調節等。TGF-β1是腎纖維化的關鍵因素,Smad蛋白是TGF-β家族信號從受體到核的細胞內轉導分子,TGF-β1/Smad信號轉導通路在腎纖維化的發生發展中起重要作用[5-6]。通過免疫組化方法發現，黃芩素可顯著降低腎組織中TGF-β1和Smad-2的蛋白表達，表明黃芩素可能通過抑制TGF-β1/Smad信號轉導通路來發揮抗腎纖維化作用。

總之，黃芩素可改善腎臟損傷，對腎臟有一定保護作用，但不能完全逆轉腎纖維化狀態。

A假手術組 B模型組 C科素亞組 D黃芩素高劑量組 E黃芩素低劑量組

A假手術組 B模型組 C科素亞組 D黃芩素高劑量組 E黃芩素低劑量組

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