miR－3960真核表達載體的構建及其對成骨細胞礦化的影響＊

陜西省人民醫院（西安710068） 李 輝 郭 劍 張 艷 龐雅玲 李曉燕 吳貴福

miRNAs是一類小的單鏈內源性非編碼RNA，能夠與靶mRNA的特定序列結合，通過降解靶mRNA或抑制翻譯發揮其重要的調控作用。目前研究已發現miRNAs在細胞分化與凋亡、生長發育、糖脂代謝、炎癥、免疫應答以及腫瘤發生等多個生理和病理過程中均扮演著關鍵的角色［1－2］，其在成骨細胞分化調控過程中的作用也已被多個實驗證實。miR－3960是最近發現的一個新的在成骨細胞表達的miRNA，其表達水平隨成骨細胞的分化進程而逐步增加，提示其可能在成骨細胞分化過程中發揮一定作用。為明確miR－3960對成骨細胞礦化的影響，本研究將miR－3960的前體序列克隆入真核表達載體pSilencer 4.1－CMV puro中，并將其穩定轉染ST2細胞，觀察miR－3960對成骨細胞礦化的影響，為深入研究miR－3960在成骨細胞分化中的作用機制奠定基礎。

材料與方法

1 材 料 pSilencer 4.1－CMV puro載體購自美國Ambion公司。rTaq DNA聚合酶、T4DNA連接酶購于大連寶生物公司。BamH I、Hind III內切酶購自美國NEB公司。DNA膠回收試劑盒購自美國QIAGEN公司。小鼠基質細胞ST2購買自日本RIKEN生物資源中心；α－MEM培養基及胎牛血清（FBS）購自美國GIBICO公司。人重組BMP－2蛋白購于美國Peprotech公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。其余試劑均為國產分析純。

2 方 法 ①miR－3960表達載體的構建：根據miR－3960的前體序列設計引物，兩條引物的5′分別含有BamH I和Hind III酶切位點，引物由上海英駿生物技術公司合成并純化。P1：5’－GATCCGGCCACGGCTTCCTGCGCCCCCGATCGGGGCCGCCAACA GCGCTGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGGGGCAGT GGCGGAAA－3’；P2：5’－AGCTTTTCCGCCACTGCCCCCGCCTCCGCCGCCGCCGCCAGCGCTGTT GGCGGCCCCGATCGGGGGCGCAGGAAGCCGT GGCCG－3’。將合成的兩條寡核苷酸用去離子水稀釋成100μmol/L，各取2μl，與46μl退火緩沖液混合，95℃4min，70℃10min，30℃30min，緩慢降溫至4℃得到退火雙鏈DNA。隨后對pSilencer 4.1－CMV puro進行線性化：用BamH I和Hind III對質粒進行雙酶切，反應體系為：質粒10μl，10緩沖液4μl，BamH I 2μl，Hind III 2μl，去離子水22μl，37℃酶切3h，酶切產物經1%瓊脂糖膠電泳，用DNA膠回收試劑盒回收線性載體片段。將線性化質粒與退火后的產物于16℃連接過夜。制備感受態細胞大腸桿菌DH5α，連接產物轉化DH5α感受態細胞，在氨芐青霉素抗性LB平板上篩選重組載體。擴增白色的抗性菌落，提取質粒并以BamHⅠ和HindⅢ限制性內切酶酶切鑒定重組質粒。把酶切鑒定正確的重組質粒送南京金思特公司使用pSilencer 4.1－CMV puro通用引物進行測序，質粒命名為pSilencer4.1－miR－3960。②小鼠基質細胞ST2培養：細胞在含有10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的α－MEM中培養。細胞置于37℃、飽和濕度及5%CO2條件下培養。每周換液2次，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。當誘導ST2向成骨細胞分化時在培養基中加入300ng/ml BMP－2。③pSilencer4.1－miR－3960穩定轉染ST2細胞：ST2細胞或BMSCs以3×104細胞/孔的密度接種24孔板，加入不含抗生素的α－MEM培養液培養至細胞匯合達到70%左右時進行轉染。取pSilencer4.1－miR－3960 0.8μg，Lipofectamine 2000 2μl用50μlα－MEM 稀釋，輕柔混勻，室溫孵育5min；將以上兩液體輕輕混勻，室溫靜置20min，使脂質體包裹質粒；輕柔混勻轉染液體，慢慢滴入培養板中，輕微晃動培養板后放入37℃5%CO2培養箱中，培養48h后加入嘌呤霉素（1μg/ml）進行篩選，待大部分細胞死亡，并有陽性克隆長出時，在顯微鏡下選定抗性克隆并予以標記，用無菌槍頭刮吸克隆生長的細胞，轉入25ml培養瓶擴大培養。轉染空質粒（miR－C）為對照組。④Northern雜交：將RNA樣品加入等體積的凝膠上樣緩沖液，65℃熱變性10min后立即于冰上放置1min，加入15%的尿素變性聚丙烯酰胺凝膠的上樣孔中，180V電壓電泳至溴酚藍指示帶到達凝膠底部，取下凝膠，在含1μg/ml EB的0.5×TBE中浸泡5min，漂洗3～5min，用紫外凝膠成相系統檢測RNA的完整性及電泳情況。隨后使用半干電轉移裝置，400mA恒流轉1h，取出尼龍膜在0.5×TBE溶液中漂洗數秒，置于濾紙上晾干，紫外線交聯125mJ。將膜置于雜交管中，加入10ml完全溶解的Hyb雜交液，于37℃預雜交1h，然后換用10ml已加入溶解的探針并充分混勻的Hyb雜交液，于37℃雜交過夜；用2×SSC，0.1%SDS溶液在室溫漂洗2次，再用0.5×SSC，0.1%SDS于室溫洗膜1次。壓片，－70℃X光曝光24～48h，顯影、定影。選用U6為內參照，同一張膜經洗脫后，加U6探針按上述步驟雜交顯影。⑤鈣沉積量測定：ST2細胞轉染后，用α－MEM培養液培養于24孔板，其中含10%FBS、青霉素50U/ml、慶大霉素50μg/ml、BMP－2 300ng/ml、抗壞血酸50mg/ml以及10mMβ－甘油磷酸鈉，培養5d后進行鈣沉積量測定。用不含Ca2＋、Mg2＋的PBS洗細胞3次，每孔細胞加入500μl 0.6NHCl，4℃慢搖過夜，第2天收集每孔液體，1000g離心5min，取上清與1ml o－cresolphthalein－complex混勻后用分光光度計在575nm波長下測量。

3 統計學處理 各實驗獨立重復3次，重復性好，所選圖表為重復實驗的結果之一。所有統計分析均采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較用方差分析，P＜0.05認為有統計學差異。

結 果

1 miR－3960表達載體鑒定 按miR－3960前體設計引物，將合成的兩條寡核苷酸引物退火，形成雙鏈后連接pSilencer 4.1－CMV puro載體，轉化DH5α細菌，抽提質粒，采用HindIII及BamHI雙酶切鑒定，由圖1可見酶切釋放大小分別為4.8kb和73bp的兩個片段，與預期相符。隨后質粒送交南京金思瑞公司測序證實序列正確（圖2），證明載體構建成功。

圖1 pSilencer4.1－miR－3960表達載體酶切圖

圖2 miR－3960連接pSilencer 4.1－CMV puro經酶切后測序圖譜

2 Northern印記雜交檢測miR－3960表達 圖3顯示在分別轉染miR－3960表達載體及miR－C 48h后，兩組BMP－2誘導的ST2細胞中 miR－3960的表達差異。Northern印記雜交的結果顯示，pSilencer4.1－miR－3960組中miR－3960有較強的表達，而對照組中則未檢測到miR－3960表達。表明miR－3960表達載體的轉染成功實現miR－3960在BMP－2誘導的ST2細胞中的過表達。

圖3 轉染miR－3960表達載體或miR－C的BMP－2誘導ST2細胞中miR－3960的表達

3 miR－3960對成骨細胞礦化的影響 穩定轉染pre－miR－3960后用BMP－2持續誘導ST2向成骨細胞分化5d，用鄰甲酚酞絡合銅比色法檢測細胞中鈣沉積量。如圖4所示，miR－3960過表達的細胞在同樣誘導條件下對鈣沉積量的增加作用較對照組顯著。

圖4 miR－3960過表達對ST2細胞鈣沉積量的影響

討 論

近年來的研究發現多個miRNA參與調控成骨細胞的分化，如miR－26a能作用于SMAD1發揮對成骨分化的抑制作用［3］。miR－133和 miR－135分別作用于Runx2和SMAD5，抑制二者表達，進而抑制成骨細胞的分化［4］。而 Mizuno等［5］發 現 miR－210 能 夠 促 進ST2細胞向成骨細胞分化，其機制是miR－210抑制AcvR1b，從而抑制TGF－beta/activin信號通路。我們之前的研究也證實一個在成骨細胞高表達的miRNA——miR－2861可以通過抑制HDAC5的表達來發揮其促進成骨細胞分化的作用［6］。本研究選取另一個在成骨細胞高表達的miRNA——miR－3960作為研究對象，成功構建miR－3960的表達載體，并將其穩定轉染于ST2細胞，明確其可以促進成骨細胞的礦化。

miRNA的產生過程是一個由多個酶介導的多步驟的過程［7］。首先在體內生成長度在100～1000nt的初級轉錄物（pri－miRNA），隨后被剪切成長度約在65～100nt并具有莖環結構的miRNA前體（pre－miRNA），再由ATP依賴的核酸內切酶Dicer將其剪切成19～26nt長的miRNA。只有成熟的miRNA才能通過與靶mRNA的特定序列結合，進而負性調控靶基因表達。

根據miRNA生成過程的這一特點，要達到在細胞中達到過表達miRNA的目的，通常需要擴增miRNA發夾結構及一些側翼序列，并直接克隆PCR產物，將該產物連接到質粒或病毒載體，然后將其轉染進入細胞，由細胞內Dicer作用后生成成熟的miRNA，這符合miRNA的一般生物合成過程和作用原理，效果穩定。本研究選取pSilencer 4.1－CMV作為連接載體，該載體上攜帶有RNA聚合酶II啟動子，其連接發夾結構的siRNA轉染細胞來獲得siRNA表達已被廣泛應用。miR－3960的前體pre－miR－3960長度為73 bp，根據miRbase數據庫中提供pre－miR－3960序列，我們設計了一對引物，并在引物的5’端分別加了BamH I和HindⅢ酶切位點，退火后得到含酶切位點的pre－miR－3960，隨后用BamH I和HindⅢ進行酶切后，將其克隆至pSilencerm4.1－CMV puro載體中構成miRNA－3960的表達質粒。將該質粒送交公司經測序證實序列完全正確。隨后將該表達載體穩定轉染于ST2細胞后，檢測到miR－3960表達水平顯著增加，進一步證實載體構建成功。這說明pSilencer 4.1－CMV用來構建miRNA表達載體是有效可行的。Lee等［8］用pSilencer 4.1－CMV構建的 miR－15a表達載體轉染PCK－CCL細胞后同樣能夠使miR－15a在細胞內高表達。為明確miR－3960對成骨細胞礦化的影響，本研究選取鈣沉積量作為觀察指標。在ST2細胞中穩定轉染miR－3960表達載體，并加用BMP－2誘導ST2細胞向成骨細胞分化，結果表明miR－3960過表達組鈣沉積量明顯增加，提示miR－3960可以促進成骨細胞礦化。

綜上，本實驗成功構建了miR－3960的表達載體，且實驗證明其可以促進成功細胞的礦化，為進一步研究miR－3960在成骨細胞分化中的作用提供了較好的實驗基礎。由于miRNA發揮調控作用是通過與靶mRNA的特定序列結合來實現的，因此下一步我們將研究其可能作用的靶基因，深入探討miR－3960在成骨細胞分化中的作用機制

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