傳染性法氏囊病病毒PY05株的分離鑒定

盧佳 張宇耕 崔保安 李新生 劉媛媛 陳禮鵬 岳旭龍 王俊亞

摘要：為了分離到雞傳染性法氏囊病（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ，ＩＢＤ）病毒，從河南省濮陽地區某疑似感染雞法氏囊病病毒的雞場采集病料，用ＳＰＦ雞胚對病毒進行分離培養，通過瓊脂擴散試驗和ＲＴ－ＰＣＲ擴增ＶＰ４片段對其進行鑒定。結果顯示該毒株能引起雞胚規律性死亡，且出現ＣＡＭ增厚、雞胚出血等明顯病變；待檢抗原、標準陽性血清之間出現陽性沉淀線；瓊脂電泳得到大小約為１ ２００ｂｐ片段，與預期結果相符。結果證明該分離株為ＩＢＤＶ地方株，并命名為ＰＹ０５株。

關鍵詞：雞傳染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）；分離；鑒定

中圖分類號：Ｓ８５８．３１文獻標識碼：A文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０12）04-0009-02

雞傳染性法氏囊病（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ，ＩＢＤ）是由雞傳染性法氏囊病病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＩＢＤＶ）引起的雞的急性、高度接觸性、殺淋巴細胞性傳染病［１］。該病主要侵害３～１２周齡幼雞，以損傷雞的法氏囊為主要特征，使雞群產生嚴重、長期的免疫抑制，從而對其他細菌及病毒性疾病繼發感染的敏感性增加［２］。給養殖業帶來嚴重的經濟損失。本試驗從河南省濮陽地區某雞場疑似傳染性法氏囊病的雞群中采集病料進行分離，通過血清學等方法對該毒株進行了鑒定。現將鑒定過程報告如下。

１材料與方法

１．１材料

病料采自河南省濮陽地區某小型養雞場的疑似傳染性法氏囊病病雞的法氏囊、脾臟組織；ＳＰＦ雞胚及ＳＰＦ雞購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；ＩＢＤＶ陽性血清購自中國獸醫藥品監察所；ＲＮＡ提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。

１．２方法

１．２．１病料的處理將采集的病料剪碎、充分研磨后按１∶３的比例加入滅菌的ＰＢＳ液，制成勻漿后反復凍融３次，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，將處理后的懸液用無菌ＥＰ管分裝，于－８０℃保存備用。

１．２．２病毒的分離與傳代將１．２．１處理的原始病料懸液滴鼻、點眼接種５只４周齡ＳＰＦ雞，撲殺在接種后３～４ ｄ出現臨床癥狀的病雞，采集法氏囊混合，按１．２．１的方法處理制成懸液。懸液按１∶１０４倍稀釋，０．２ｍＬ／胚接種１０日齡ＳＰＦ雞胚絨毛尿囊膜，３７℃孵育，棄去２４ｈ內死亡雞胚，其余２４ｈ后死亡的雞胚無菌收取尿囊膜、尿囊液，混合，研磨后８ ０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，連續５次傳代。

１．２．３瓊脂擴散試驗 按常規方法測定發病雞只中的ＩＢＤＶ抗原，梅花形孔中央加入ＩＢＤＶ標準陽性血清，外周孔加入已處理過的法氏囊組織，另外加入ＩＢＤＶ標準抗原做對照。

１．２．４病毒ＲＮＡ的提取處理過的病料使用Ｔｒｉｚｏｌ離心柱型高純總ＲＮＡ快速提取試劑盒按其產品說明的方法提取。

１．２．５引物的設計與合成參照ＧｅｎＢａｎｋ有關ＩＢＤＶ病毒ＶＰ４片段序列及Ｐｒｉｍｅｒ５．０軟件設計一對引物Ｐ１和Ｐ２，進行ＲＴ－ＰＣＲ反應［３］。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下：Ｐ１：５′－ＧＣＡＴＡＣＴＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＧＧＧＣＧＧＧＧ－３′；Ｐ２：５′－ＣＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＡＴＧＧ－３′。

２結果與分析

２．１病毒的分離與傳代

接種的雞胚于４８～９６ｈ內死亡，收集的雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液研磨處理后在雞胚上連續５次傳代。該病毒在雞胚上死亡時間穩定在６０ｈ左右，且雞胚絨毛尿囊膜（ＣＡＭ）明顯增厚，胚體出血（圖１，圖２）。

２．２瓊脂擴散試驗

待檢抗原、標準抗原與陽性血清之間出現的沉淀線完全融合，顯示為陽性（圖３）。

２．３ＲＴ－ＰＣＲ擴增結果

ＰＣＲ產物通過１％的瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統顯示，片段大小為１ ２００ｂｐ左右，與預期相符合（圖４）。

３小結與討論

從河南省濮陽地區某疑似傳染性法氏囊病的雞群中采集病料，通過瓊脂擴散試驗、分子生物學試驗等檢測方法，證實分離的病毒為雞傳染性法氏囊病病毒，將其命名為ＰＹ０５株。該病毒在雞胚傳代過程中，可引起雞胚規律性的死亡，產生明顯的病變。通過瓊脂擴散試驗，顯示為陽性，出現明顯的沉淀線。ＲＴ－ＰＣＲ擴增結果顯示，得到與預期相符合的１ ２００ｂｐ左右的片斷［4］。

ＩＢＤＶ主要侵害雞的中樞免疫器官—法氏囊，能引起雞的免疫抑制，從而對其他細菌性及病毒性疾病的易感性增強，給養雞業帶來嚴重的經濟損失［５］。目前雞傳染性法氏囊病仍是養禽業防制的主要對象，對于該病的預防，傳統的預防措施主要是使用弱毒疫苗和滅活疫苗來控制疾病的感染［6］，盡管源于經典毒株的各種法氏囊病疫苗在防制傳染性法氏囊病的過程中起到重要的作用，但由于變異毒株和超強毒株的出現，現有的疫苗不能提供有效保護，常導致免疫失敗和帶來經濟損失［7］。因此，尋找合適的方法研制新型疫苗，也成為獸醫工作者面臨的重要課題。另外，養雞戶在對雞群進行ＩＢＤ免疫同時，應加強飼養管理、保持環境衛生、減少其他疾病的發生和影響，這樣才能更好更有效的預防ＩＢＤ的發生［8］。

參考文獻：

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［8］王永強．雞傳染性法氏囊病病毒ＶＰ３及 ３＇ＵＴＲ對病毒復制的影響［Ｄ］． 北京：中國農業科學院，２００９．