鴨大腸桿菌病區域優勢血清型疫苗研究報告(Ⅰ報)

羅玲 楊峻 邵華斌 王紅琳 羅青平 溫國元 張蓉蓉 艾地云 羅明杰

摘要：用鑒定篩選的大腸桿菌接種適宜培養基，將培養物經甲醛溶液滅活后，分別制備氫氧化鋁膠滅活疫苗、油乳劑滅活疫苗，經檢驗合格，用于安全和效力試驗，比較兩種佐劑制備的滅活疫苗的免疫效力。結果表明，氫氧化鋁膠作為佐劑制備區域優勢血清型疫苗來預防本地的鴨大腸桿菌病效果更好。

關鍵詞：鴨大腸桿菌病滅活疫苗；佐劑；免疫效果

中圖分類號：Ｓ８５８．３２文獻標識碼：A文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０12）04-0013-0

禽大腸桿菌是一種潛在的人畜共患病病原［１］，鴨大腸桿菌病的發生日趨嚴重，給養鴨業造成了嚴重的經濟損失。由于鴨大腸桿菌的耐藥日趨嚴重，疫苗免疫成為預防該病的有效手段，但大腸桿菌病流行廣泛，其血清型眾多，不同地區差異較大，國內外還沒有有效的疫苗來防治該病，所以用本地分離鑒定和篩選的病原菌株來制備多價滅活疫苗對預防該地的鴨大腸桿菌病效果更好。本研究選用從湖北省分離鑒定篩選的３株疫苗菌株制備氫氧化鋁膠滅活疫苗，經安全性、免疫效力試驗證明此疫苗效果較理想。

１材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１試驗用菌種試驗用菌種及效力檢驗用強毒均由本實驗室鑒定、保存和提供。

１．１．２試驗鴨為地方麻鴨，購買后飼養觀察７ｄ無異常，即用于后續試驗。

１．２試驗用疫苗制備與檢驗

１．２．１制苗用菌液的制備用玻璃瓶或培養罐通氣培養，按容積裝入７０％培養基及花生油消沫劑。滅菌后按培養基量的２％～４％接種各菌株混合的二級種子液，各菌株種子混合比例為ＥＣ７８∶ＥＣ４５∶ＥＣ８為１∶１∶１。開始小量通氣，逐漸增大氣量，３６～３７℃培養１０～１４ｈ。菌液培養完成后取樣作純粹檢驗［２］（應達到純粹標準）。同時活菌計數［２］，每毫升活菌應不低于１５億個。按０．４％加入甲醛溶液，經３８℃滅活４８～７２ｈ，期間每隔４～６ｈ振搖一次，作滅活檢驗［２］。

１．２．２疫苗的制備

１．２．２．１氫氧化鋁膠滅活疫苗的制備每５份菌液加１份氫氧化鋁，同時按總量的０．００５％加硫柳汞，充分振蕩，于２～８℃靜置２～３ｄ，抽棄上清濃縮成全量的６０％，于２～８℃條件下保存備用。

１．２．２．２油乳劑滅活疫苗的制備

油相制備：注射用白油９４份、司本－８０ ６份、硬脂酸鋁２份，配油相時，先取少量注射用白油與硬脂酸鋁混合，加熱溶化，再與全量司本－８０及注射用白油混合均勻，１１６℃滅菌３０ｍｉｎ，備用。

水相制備：吐溫－８０ ４份裝入帶玻璃珠的瓶中滅菌，冷卻后加入菌液９６份，充分振搖，使吐溫－８０完全溶解為止。

乳化：取油相３份放于膠體磨內，慢速轉動攪絆，同時緩慢加入水相１份，加完后再以１０ ０００ｒ／ｍｉｎ攪拌２～５ｍｉｎ，在終止前加入１％硫柳汞溶液使其最終濃度為０．００５％。乳化后，取３～５ｍＬ以３ ０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，若有分層現象，應重復攪拌１次。

１．２．３疫苗的檢驗對制備的疫苗進行無菌、安全性和效力檢驗。

１．２．３．１無菌試驗按文獻［２］介紹的方法進行無菌檢驗。

１．２．３．２疫苗的安全試驗選取１周齡的健康易感鴨３０只，分３組，每組１０只。第１組采用制備的氫氧化鋁膠疫苗頸部皮下或肌肉注射１ｍＬ／只；第２組采用油乳劑疫苗頸部皮下或肌肉注射１ｍＬ／只；第３組頸部皮下或肌肉注射滅菌生理鹽水１ｍＬ／只。觀察１４ｄ。

１．３兩種佐劑疫苗免疫效果比較試驗

選取２周齡健康易感鴨４０只，分４組，每組１０只。第１組每只頸部皮下接種氫氧化鋁膠滅活疫苗０．５ｍＬ，第２組每只肌肉注射氫氧化鋁膠滅活疫苗０．５ｍＬ，第３組每只頸部皮下接種油乳劑滅活疫苗０．５ｍＬ，第４組為對照組，不接種任何疫苗。免疫后２１ｄ，各組肌肉注射強毒株混合液０．５ｍＬ／只（含活菌２億～５億個），觀察１４ｄ，記錄每組健活數和死亡數，計算每種疫苗免疫攻毒保護率。

２結果與分析

２．１疫苗的無菌試驗結果

試驗結果表明，兩種佐劑制備的疫苗均無菌生長。

２．２疫苗的安全性試驗結果

由表１可見，兩種佐劑制備的疫苗免疫的７日齡雛鴨均健活，精神、食欲正常，迫殺剖檢無任何肉眼可見病變。

２．３兩種佐劑疫苗免疫效果試驗結果

由表２可見，氫氧化鋁膠疫苗和油乳劑滅活疫苗免疫１４日齡的雛鴨，免疫保護率均不低于８０％，達到疫苗規定的要求。

３小結與討論

本試驗用從湖北地區篩選的菌株制備氫氧化鋁膠滅活疫苗和油乳劑滅活疫苗，并進行了安全性和免疫效果的比較試驗。安全性試驗結果表明，用兩種佐劑制備的疫苗免疫鴨，試驗鴨均健活。免疫效果試驗結果油乳劑滅活疫苗和氫氧化鋁膠滅活疫苗可以達到同等的免疫保護率（不小于８０％），但是在用油乳劑滅活疫苗進行免疫時部分雛鴨產生了一定的應激反應，氫氧化鋁膠滅活疫苗進行免疫時雛鴨沒有應激反應。試驗結果表明，選用氫氧化鋁膠作為佐劑制備區域優勢血清型疫苗來預防本地的鴨大腸桿菌病效果更好。

參考文獻：

［１］卡爾尼克Ｂ Ｗ． 禽病學［Ｍ］．高福，劉文軍，主譯．第九版．北京農業大學出版社，１９９１．４２７－４４４．

［２］中國獸藥典委員會．中華人民共和國獸藥典（２００５年版）［Ｍ］． 中國農業出版社，２００５．