腋臭患者ApoD表達變化及其分子機制的研究

陳輝 穎利　杜潔　王芳芳

[摘要]目的：觀察與E-3M2H分泌相關的載脂蛋白D（ApoD）和雄激素受體AR在腋臭患者的大汗腺的表達與正常人的差異，探討導致腋臭患者ApoD表達異常的原因。方法：收集4例正常對照和10例腋臭患者的組織樣本，采用免疫組化、realtime-PCR和western-blot檢測腋臭患者組織中ApoD、AR的表達水平，通過細胞培養和激素誘導，分析AR信號調控ApoD表達的可能性，并闡明JNK1信號通路在其中扮演的作用。結果：實驗發現ApoD和AR在腋臭患者的大汗腺的表達與正常人有明顯的差異，腋臭患者中ApoD表達幾乎是正常人的2倍；而腋臭患者中AR表達也明顯增加，與此同時，腋臭患者中JNK1活化增強。雄激素可以增強正常人ApoD的表達，且該過程中同樣伴有JNK1活化；抑制JNK1活化，可以降低腋臭患者和雄激素誘導的ApoD的表達。結論：ApoD表達增加是腋臭患者的重要分子特征，其表達增加與AR 信號增強密切相關。JNK1的活化是腋臭患者和雄激素導致的ApoD表達增加的重要原因，抑制JNK1活化，可以抑制腋臭患者內源和雄激素誘導的ApoD的表達。

[關鍵詞]腋臭；載脂蛋白D（ApoD）；JNK；表達調控

[中圖分類號]R758.74[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）11-1956-05

腋臭是整形美容外科的常見病，給患者帶來很大的精神和心理壓力，影響正常的生活和工作。目前治療腋臭的方法很多，治療效果多不相同，具有一定的創傷和并發癥。進一步闡明腋臭發生的分子機制，在深入認識腋臭發生病理機制的同時，有望發現無創治療腋臭的新手段，對腋臭治療具有重要的意義。研究表明，（E）-3-甲基-2-已烯酸（E-3M2H）的分泌在腋臭發生過程中具有重要作用，而載脂蛋白D（ApoD）是調控其分泌的重要分子。然而，腋臭患者中ApoD的表達情況及其與腋臭的關系尚不清楚。深入分析腋臭患者中ApoD的表達及其機制，對于認識腋臭的發生具有重要的意義。本研究將集中探討腋臭患者AR和ApoD的表達變化及其相關性；分析AR信號是否可能調節大汗腺中ApoD的表達，特別是JNK1信號在其中扮演的可能角色。

1材料和方法

1.1 臨床樣本收集：收集2009年10月到2010年5月在第四軍醫大學唐都醫院整形激光美容中心手術治療腋臭的男性患者腋下組織標本10例，同時募集4例男性志愿者（瘢痕修復患者或其他原因）。術中取患者左右兩側腋下新鮮皮膚組織約6cm×0.3cm×0.3cm（深及脂肪層）。

1.2 細胞培養：取自患者和志愿者的腋窩處皮膚經D-Hanks液沖洗后，剔除脂肪組織。用眼科手術剪將皮膚剪成1mm3的小組織塊。然后用II型膠原酶孵箱中消化1天。1天后，鏡下獲取汗腺組織，移入新的培養瓶中培養，加入少許培養基，待汗腺組織塊貼壁后繼續加入2ml培養基繼續培養。 每2～3天換液一次。通常汗腺上皮中混有成纖維細胞，而后者與汗腺上皮相比，貼壁較差。 為了純化汗腺上皮細胞，通過胰酶分步消化的方法獲取汗腺上皮細胞。胰酶消化后，首先脫落的是成纖維細胞，吸棄后，繼續消化依然貼壁的汗腺上皮，則能獲取較為純的汗腺上皮細胞。整個過程中，細胞培養采用DMEM+10% FBS。

1.3 細胞處理

1.3.1 JNK抑制劑處理：將上述培養的腋臭患者細胞鋪板于6孔板，隔夜培養，待細胞長至70%后給予JNK抑制劑處理，抑制劑濃度為10-6M，繼續培養24h后，收集細胞用于基因表達檢測。

1.3.2 5α-DHT處理：將培養的正常人細胞鋪板于6孔板，隔夜培養，待細胞長至70%后給予5α-DHT 處理，劑量分別為10-7M 和10-6M 。此外，我們還在10-6M 濃度的5α-DHT基礎上聯合添加JNK抑制劑處理，抑制劑濃度為10-6M，繼續培養24h后，收集細胞用于基因表達檢測。

1.4 Western Blot檢測目的基因表達

1.4.1 收集蛋白樣品（Protein sample preparation）：將處理完的細胞，PBS洗滌后，按每孔加入80μl的RIPA蛋白裂解液，冰上孵育30min。收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，采用Pierce 公司的BCA蛋白定量試劑盒測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。將適量濃縮的5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液加入收集的蛋白樣品中。沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白，離心后取上清備用。

1.4.2. 電泳（Electrophoresis）：首先配制SDS-PAGE凝膠，制備好后，把蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內。為便于觀察電泳和轉膜效果、判斷蛋白分子量大小，在邊緣加樣孔中加入預染蛋白質分子量Marker。

1.4.3 轉膜（Transfer）：本實驗中使用硝酸纖維素膜（NC膜）進行轉移。轉移條件為：電流為200mA，轉膜時間為120min。整個過程在冰浴中進行。根據預染蛋白質分子量Marker，判斷轉膜的效果。

1.4.4 封閉（Blocking）：轉膜完成后，即刻把蛋白膜放到預先準備好的Western洗滌液TBST中，漂洗1～2min，洗去膜上的轉膜液。吸盡洗滌液后，加入含有10%的脫脂牛奶的Western封閉液，放置于搖床上緩慢搖動，室溫封閉120min。

1.4.5 一抗孵育（Primary antibody incubation）：按照預染Marker的指示，將目的基因所在位置的條帶剪下。參照一抗的說明書，按照合適比例用TBST稀釋一抗，達到合適濃度。用微型臺式真空泵吸盡封閉液，即刻加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜。

1.4.6 二抗孵育（Secondary antibody inucubation）：參照二抗的說明書，按照合適比例，用TBST稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗。 二抗時需要根據一抗進行選擇。例如一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需要選擇抗小鼠IgG的二抗，比如用辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG。

1.4.7 蛋白檢測（Detection of proteins）：采用碧云天的BeyoECL Plus ECL類試劑檢測蛋白。壓片采用專用的壓片暗盒（FFC58/FFC83）進行。 用顯影定影試劑盒（P0019/P0020）配制顯影液和定影液，自行手工洗片。X光片選用柯達原裝的生物實驗專用柯達X-OMAT BT膠片。

1.5 免疫組化檢測目的基因表達

1.5.1配制試劑

1.5.2 操作流程：脫蠟和水化；高壓熱修復抗原；組織切片染色；脫水、透明、封片、鏡檢、照相。

1.6 熒光定量PCR檢測目的基因表達

1.6.1 提取高質量的RNA：因為Real-Time PCR對RNA樣品的質量要求較高，在實驗過程中要防止RNA的降解，整個過程在冰上完成。具體步驟略

1.6.2 瓊脂糖凝膠電泳RNA，分析提取RNA的質量：配制1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠；取各個RNA樣品4μl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2μl混勻，加入變性膠加樣孔中。120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察，確定可見28S和18S 兩條明亮條帶，而無DNA條帶污染。

1.6.3 RNA反轉錄為cDNA。紫外分光光度計RNA定量。反轉錄體系（略）。

1.6.3.1 引物設計：由于本實驗采用SYBR Green I做 Real Time PCR，引物設計滿足特定的要求。由于RNA純化后得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進行基因表達調控研究中都會用一些看家基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。本研究用的看家基因為GAPDH。

1.6.3.2 引物質量檢測：取0.2ml薄壁PCR管，向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10μl；加入正反向引物各0.5μl（引物濃度10μM），向管中加入混合的cDNA各1μl。各管補加水至20μl。混勻，置于AB7500PCR儀中進行PCR反應。反應條件為：95℃ 5min；95℃15s，60℃34s，40cycles；加溶解曲線； 4℃終止反應。

設計的引物的溶解曲線見圖1、2。兩對引物的溶解曲線均單一，表明產物特異，可以用于下一步實驗。利用相對定量的方法分析目的基因表達量的情況，計算表達差異， 采用2-△△CT方法分析基因表達相對變化。

2結果

2.1 大汗腺的形態學觀察：大汗腺的分泌活動有可能在機體內環境和外部因素的變化下，在活躍期和靜息期之間往復循環。我們對大汗腺的形態學研究發現在腋臭標本和正常標本切片中均可以看到各種分泌時期的大汗腺，但對照組的大汗腺組織明顯少于腋臭組，有的切片幾乎沒有。分泌活躍期的大汗腺管腔小，細胞呈柱狀并且頂部凸出到管腔中央形成帽狀物，有的已經脫離大汗腺游離到管腔中央（圖3）。分泌靜息期的大汗腺管腔大，細胞呈扁平狀，沒有凸出到管腔的分泌物（圖4）。

2.2 ApoD、AR免疫組織化學結果：腋臭組大汗腺細胞漿內可見密集分布的棕黃色深染顆粒，ApoD的表達呈強陽性（圖5）。正常對照組大汗腺細胞漿內僅見少量棕黃色淺染顆粒，ApoD表達呈弱陽性（圖6）。ApoD在腋臭組大汗腺中的表達高于對照組。正常對照組中大汗腺細胞核內僅有少量棕黃色淺染顆粒，AR的表達呈弱陽性（圖7）；而腋臭組大汗腺細胞中可見核內密集分布的棕黃色深染顆粒，AR的表達呈強陽性（圖8）。

2.3 Real-time檢測ApoD的表達差異：我們提取了10例腋臭的男性患者和4例正常對照的腋下組織標本，對其中ApoD的表達進行了檢測。結果發現，4例正常對照中ApoD表達水平相對較低，而10例腋臭患者中ApoD的表達水平則比較高。腋臭患者中ApoD的平均表達水平是正常的2倍左右 （圖9）。秩檢驗發現二者有統計學差別。

2.4 腋臭患者JNK1活化增強：對上述14例樣本進行蛋白表達檢測也發現類似的結果。同時，我們檢測了JNK1的表達和活化情況。結果發現，JNK1表達在正常和腋臭患者之間沒有顯著差別，而腋臭患者中JNK1的磷酸化明顯增強（圖10），表明腋臭患者中JNK1的磷酸化明顯增強，提示增強的JNK1信號可能是腋臭發病的重要分子事件。

在上述研究的基礎上，我們進一步探討了抑制JNK1信號，能否減少ApoD的表達。為此，我們培養了腋臭患者的汗腺細胞。將培養的細胞鋪板于6孔板后，給予JNK1抑制劑SP600125處理。結果發現，JNK1抑制劑能夠有效地抑制JNK1的磷酸化和ApoD的表達水平（圖11），提示JNK1是ApoD表達增加的重要原因。

為了進一步分析JNK1調控ApoD表達究竟是發生在蛋白水平，還是RNA水平。我們又進一步分析了ApoD的RNA表達水平。RT-PCR檢測發現，JNK1抑制劑同樣能夠有效抑制ApoD的RNA表達水平（圖12）。表明JNK1是通過調控ApoD的轉錄影響ApoD的表達的。

先前的研究發現，AR可以調控JNK1的活化；而JNK1同樣可以促進AR的轉錄活性。為此，我們進一步探討了AR信號是否通過影響JNK1的活化調控ApoD的表達，還是其他信號引起JNK1活化，后者引起AR轉錄活性增強，進而引起ApoD表達增強。培養正常人汗腺細胞后，給予10-7M、10-6M的5α-DHT刺激。24h 5α-DHT刺激，濃度依賴的增強ApoD的表達，而JNK1則能一定程度的抑制ApoD的表達增加 （圖13）。所有這些證據提示AR信號可以以JNK1依賴和非依賴兩種方式調控ApoD的表達。

在RNA水平，我們觀察到類似的現象（圖14）。5α-DHT濃度依賴的增強ApoD的mRNA水平，而JNK1則能一定程度的抑制ApoD的表達增加。

3討論

腋臭是一種常見病，漢族人的發病率是4.56%[1]，有家族遺傳性[2]。該病的確切發病機制尚不明確，近年來的研究[3]認為與大汗腺分泌功能異常有關，大汗腺細胞在腋臭發生中起重要的作用。已有研究[4]證明大汗腺分泌物氣味結合蛋白（aprocrine secretion odor-binding protein， ASOB）與腋臭重要氣味分子E-3-甲基-2-已烯酸（E-3-methyl-2- hexenoic acid E-3M2H）的分泌相關。臭味的主要成分是E-3M2H，其中也有一定量的揮發性硫化合物[5]。性激素對腋臭有一定調控作用[6]，所以此病高發于青春期。Kurata等人的實驗研究表明，腋部大汗腺是雄激素受體（androgen receptor，AR）的靶器官[7]。Beier等[6]指出大汗腺的細胞核中有雄激素受體的表達，這種表達無性別差異。人大汗腺中的ASOB有兩種形式：ASOB1和ASOB2[8]，ASOB2在氣味的運輸過程中起主導作用[9]。E-3M2H在細胞質中同ASOB2分子的N-末端的谷氨酰胺殘基以共價鍵結合形成復合物，該復合物由ASOB2分子運輸到皮膚表面后被細菌分解成化合物E-3M2H和3羥基-3甲基已酸（HMHA）和谷氨酰胺（Gln），從而產生特殊的臭味。但也有報道，在無菌條件下培養的大汗腺細胞也可以產生特殊的臭味[10]。AR和ASOB間有著復雜的調控關系，也是腋臭發生機制中的重要環節，我們也從形態學和蛋白水平研究了AR和ASOB在大汗腺細胞中的表達及其相關性，還有待從基因水平進行研究和驗證。E-3M2H的分泌增加是腋臭發生的重要分子基礎，而ApoD是調節E-3M2H分泌的重要基因。

綜上可見，E-3M2H的分泌多少是腋臭發生的起始因素，而ApoD基因自身及其調控因素的差異可能是疾病發生的原因。性激素通過其受體調節基因的活性，調控ApoD表達，參與重要生理和病理過程。截至目前，激素水平和激素受體在腋臭發生發展中的作用研究還很少。而最近在前列腺癌的研究表明AR可以調節ApoD的表達[11]，提示AR信號可能參與了腋臭發病過程中ApoD的表達調控。

本研究發現，AR信號可以通過JNK1刺激ApoD的表達；但抑制JNK1并不能完全阻斷AR信號對ApoD的表達上調；提示AR還可以通過JNK1非依賴的方式刺激ApoD的表達。此外，JNK1本身可以刺激AR的轉錄活性，提示JNK1 可能通過調控AR信號調節ApoD的表達。因此，可以設想AR信號和JNK1信號之間存在某種反饋。需要指出的是，JNK1的活化不僅受到激素的調控，體內多種刺激可以促進JNK1的活化，而腋臭患者中JNK1活化增強有無其它因素同樣是值得探討的重要科學問題。

綜上，本部分實驗我們發現：AR信號可以通過活化JNK1，促進ApoD的表達。進一步研究JNK1活化和ApoD表達在腋臭發生中的作用，對加深腋臭發病機制的認識和無創治療腋臭具有重要的意義。

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[收稿日期]2012-07-21[修回日期]2012-09-28

編輯/張惠娟