成骨誘導后的骨髓間充質干細胞對外周血單個核細胞增殖的免疫調節作用

解芳等

[摘要]目的：探索骨髓間充質干細胞（BMSCs）及成骨誘導后的骨髓間充質干細胞（OM-BMSCs）對同種異體的外周血單個核細胞（PBMCs）的免疫調節作用。方法：分離比格犬BMSCs，成骨誘導培養基（osteogenic medium，OM）進行成骨誘導，建立BMSCs、OM-BMSCs與同種異體PBMCs的共培養體系，分三種實驗條件，共9組。A組：5×104受體PBMCs 加入5×104供體PBMCs共培養；B組：A組組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板；C組：A組組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板；D組：5×104受體PBMCs加入植物血凝素A（PHA）刺激物；E組、F組：將D組組分按B、C組方式處理；G組：5×104受體PBMCs加入IL-2炎癥因子；H組、I組：G組組分按B、C組方式處理。A、D、G組分別為三個實驗條件的對照組，單獨接種1×104/孔BMSCs、OM-BMSCs作為空白對照組Blank1組、Blank2組。以上各組分別培養120h后，應用CellTiter96 Aqueous檢測各組PBMCs的增殖情況。結果：在各實驗條件下與相應對照組相比較，BMSCs與OM-BMSCs均能抑制雙向混合淋巴細胞反應（MLR）中PBMCs的增殖，均能抑制經PHA刺激后PBMCs的增殖，均能抑制經IL-2刺激后PBMCs的增殖（P<0.01）。結論：BMSCs及成骨分化的BMSCs對刺激細胞、PHA、IL-2刺激的同種異體PBMSs的增殖均表現為抑制效應，成骨分化后的骨髓間充質干細胞對同種異體免疫反應仍具有免疫調節作用。

[關鍵詞]成骨分化；骨髓間充質干細胞；同種異體；免疫調節

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）11-1976-05

近年來，隨著組織工程的興起和發展，應用骨髓間充質干細胞（BMSCs）構建組織工程骨已成為骨組織重建修復的一個新途徑。骨髓間充質干細胞是一種具有很強自我更新能力的原始細胞，具有多向分化潛能，可分化為不同類型的細胞，如骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、肌肉細胞等[1-4]，另外研究發現BMSCs免疫原性低且有免疫調節作用。它能抑制由非特異性絲裂原（PHA等）、炎癥細胞因子（IL-2、Anti-CD3 Ab）等誘導的淋巴細胞增殖[5-8]。

自體BMSCs要達到一次治療量，需要在體外大量培養擴增，其過程可能要花大約一個月的時間。因此，對于一些急性嚴重的骨缺損，可能錯過了最佳的治療時機，將無法應用于其臨床治療。同種異體BMSCs來源廣泛，易于獲取，彌補了自體細胞來源缺乏的不足，在臨床運用上有著廣闊的前景和重要的意義。同時，成骨誘導對于構建組織工程骨至關重要，成骨分化后的BMSCs是否仍能發揮免疫調節作用，在體內各種刺激因子的作用下是否能保持免疫調節功能，這是同種異體骨組織工程體內構建成功與否的重要前提。

本實驗旨在探索成骨分化的同種異體BMSCs在三種實驗條件下（雙向MLR、PHA刺激、IL刺激）是否能發揮免疫調節功能，為進一步同種異體組織工程骨的體內構建提供免疫學理論基礎。

1材料和方法

1.1 材料：普通級成年Beagle犬3只[許可證號： SCXK （京） 2007-0005]，體重10～13kg，雌雄不限，經北京實驗動物質檢站檢測，由瑪斯公司提供，于中國醫學科學院整形外科醫院動物中心進行飼養，實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定[9]。各試劑及儀器見表1。

1.2 方法

1.2.1 犬骨髓間充質干細胞的成骨誘導分化：原代骨髓間充質干細胞接種后48h換液，去除未貼壁的細胞，繼續培養。約7天后細胞生長達80%融合，胰蛋白酶-EDTA消化，按1.6× 104/cm2密度傳代。第1次傳代后，一部分細胞加入含10nmol/L地塞米松、10mmol/L β-磷酸甘油鈉、50μmol/L L-2-磷酸抗壞血酸的DMEM成骨誘導培養基（Osteogenic Medium）；另一部分細胞作為陰性對照，仍用普通含血清培養基進行培養。以后每3天傳代1次，傳至第2代細胞，倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.2犬骨髓間充質干細胞的成骨誘導分化鑒定：茜素紅染色：制備經成骨誘導培養21天的細胞爬片，4%多聚甲醛固定2h，加入配制的茜素紅染液（茜素紅0.1g溶于蒸餾水100ml，調節pH值至7.2），染色5min，洗去染液后以丙酮洗數秒、丙酮/二甲苯洗數秒，樹酯封片后倒置相差顯微鏡下觀察。

堿性磷酸酶染色：制備經成骨誘導培養14天的細胞爬片，甲醛固定同上，BM-Purple試劑盒染色，染色后固定、封片、鏡下觀察同上。

1.2.3 第三方BMSCs、OM-BMSCs滅活備用：取第2代BMSCs、OM-BMSCs細胞懸液0.9ml，加入100μg/ml的絲裂霉素C 0.1ml，使其終濃度為10μg/ml，放置于37℃，CO2細胞培養箱滅活2h。之后分別用普通培養基、成骨培養基洗滌3次以去除殘余的絲裂霉素C，重懸后細胞計數。按照實驗分組，取1×104/孔接種于96孔板相應位置，隔天待BMSCs完全貼壁后將原有培養基吸出，進行后續實驗。另外分別單獨接種1×104/孔BMSCs、OM-BMSCs作為空白對照組（Blank1組、Blank2組）。

1.2.4 犬外周血單個核細胞（PBMCs）分離抽取2只互為同種異體比格犬外周血5ml，緩慢加入到含有3.5ml Ficoll Plus淋巴細胞分離液的15ml離心管中，離心2000rpm，20min。吸取中間白色云霧狀的有核細胞層，即分離得到PBMCs。用淋巴細胞培養基（RPMI1640培養基，含10%FBS、1%青鏈霉素、50μM 2-ME）重懸后離心1000rpm，5min，洗滌2次后細胞計數，分別作為供體細胞和受體細胞。

1.2.5 第三方BMSCs、成骨誘導的BMSCs（OM-BMSCs）對于雙向混合淋巴細胞反應（MLR）中PBMCs增殖的影響：96孔培養板共分三組，每組7個復孔，反應體系總量為200μl，不足者以淋巴細胞培養基補充。A組：將供體和受體犬PBMCs接種于96孔板中，5×104/孔，作為對照組；B組：A組各組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板；C組：A組各組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培養箱內培養120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回細胞培養箱內孵育4h，用酶標儀在490nm波長測定PBMCs的OD值。OD值（B組-Blank1）代表B組PBMCs的增殖情況；OD值（C組-Blank2）代表C組PBMCs的增殖情況。

1.2.6第三方BMSCs、OM-BMSCs對于經PHA刺激后的PBMCs增殖的影響：96孔培養板共分三組，每組7個復孔，反應體系總量為200μl，不足者以淋巴細胞培養基補充。D組：將受體犬PBMCs接種于96孔板中，5×104/孔，加入植物血凝素A（PHA），終濃度為1μg/ml，作為對照組；E組：D組各組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板； F組：D組各組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培養箱內培養120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回細胞培養箱內孵育4h，用酶標儀在490nm波長測定PBMCs的OD值。OD值（E組-Blank1）代表E組PBMCs的增殖情況；OD值（F組-Blank2）代表F組PBMCs的增殖情況。

1.2.7第三方BMSCs、OM-BMSCs對于經IL-2刺激后的PBMCs增殖的影響：96孔培養板共分三組，每組7個復孔，反應體系總量為200μl，不足者以淋巴細胞培養基補充。G組：將受體犬PBMCs接種于96孔板中，5×104/孔，加入IL-2、OKT3（anti-CD3 antibody），終濃度為100U/ml，作為對照組。H組：G組各組分加入已鋪被1×104/孔BMSCs的96孔板；I組：G組各組分加入已鋪被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培養箱內培養120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回細胞培養箱內孵育4h，用酶標儀在490nm波長測定PBMCs的OD值。OD值（H組-Blank1）代表H組PBMCs的增殖情況；OD值（I組-Blank2）代表I組PBMCs的增殖情況。

1.2.8 統計學分析：應用SPSS13.0軟件進行統計學處理，數據以x±s表示，組間均數比較行一維方差分析，P<0.05為差異有顯著性意義。

2結果

2.1 骨髓間充質干細胞體外成骨誘導分化及鑒定：應用密度梯度離心法分離得到原代BMSCs，接種培養48h 后逐漸形成大而清晰的細胞集落形成單位，貼壁細胞呈長梭形，形態類似于成纖維細胞（圖1），培養7天后，細胞融合達80%以上，胰酶消化傳代后細胞迅速進入快速增殖期，經成骨誘導培養基培養后，逐漸由長梭形漸變為短粗形或三角形（圖2）。成骨誘導后14天，堿性磷酸酶染色呈陽性，細胞胞漿呈藍、綠色