重組腺相關病毒介導的IL—32基因抑制人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的機制研究

張培華　李小川　李瑾　鄒雅琴　梁杰

[摘要]目的：探討重組腺相關病毒介導的IL-32基因抑制人瘢痕疙瘩成纖維細胞（Keloid fibroblasts，KFs）增殖的機制。方法：用重組腺相關病毒介導的IL-32（rAAV2 IL-32）及腺相關病毒空載體感染人KFs，通過熒光顯微鏡觀察rAAV2 IL-32的感染效率，RT-PCR法檢測IL-32的轉錄水平；用MTT法檢測KFs增殖的情況；用蛋白質印跡方法檢測Bcl-2、BAX、TGF-β1的表達。結果：rAAV2 IL-32及腺相關病毒空載體感染KFs 48h后，RT-PCR檢測顯示rAAV2 IL-32組出現高表達電泳條帶，而腺相關病毒空載體組則未出現電泳條帶；MTT法檢測顯示rAAV2 IL-32組明顯抑制了KFs的增殖；蛋白質印跡結果顯示rAAV2 IL-32組KFs中Bcl-2、TGF-β1表達降低，BAX表達增高。結論：rAAV2 IL-32 可能是通過減少KFs中Bcl-2和TGF-β1的表達以及增加BAX的表達來抑制瘢痕疙瘩的增殖。

[關鍵詞]白細胞介素32；瘢痕疙瘩；Bcl-2；TGF-β1；BAX

[中圖分類號]R619+.6[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）11-1987-04

人白介素32 （interleukin-32， IL-32）最早于1992年由Dahl等[1]提出，2005年Kim SH等[2]研究發現其有多種炎癥反應細胞因子的特性。目前研究證實IL-32不僅可誘導炎性細胞因子產生，而且在調節細胞增殖與凋亡中發揮重要作用[3]，臨床上已經用于防治腫瘤和結締組織疾病的研究 [4]。瘢痕疙瘩具有腫瘤樣生長的生物學特性，是一種自身免疫性、炎癥性疾病[5]。有關重組腺相關病毒介導的IL-32基因（rAAV2 IL-32）抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞（Keloid Fibroblasts，KFs）增殖的機制研究尚未見文獻報道，由此，筆者通過構建IL-32基因重組腺相關病毒表達載體并轉染KFs，研究IL-32基因對KFs增殖的影響及機制探討，從另一角度認識瘢痕疙瘩的發病機制，可能從分子水平上為瘢痕防治提供新的思路。

1材料和方法

1.1 材料：rAAV2 IL-32及重組腺相關病毒空載體（廣州萊德爾生物科技公司設計提供），KFs（廣東醫學院整形外科研究所），小牛血清和DMEM培養基（Gibco公司），MTT（Sigma公司），IL-32引物：IL32-F TCCCGAAGGTCCTCTCTGAT，IL32-R CATAATAAGCCGCCACTGTCT、BCL2引物：BCL2-F TCATGTGTG TGGAGAGCGTC，BCL2-R AGCCTCCGTTATCCTGGATC、BAX引物：BAX-F GATGCGTCCACCAAGAAGCT，BAX-R CGGCCCCAGTTGAAGTT G、TGF-β1引物：TGF-β1-FCACGTGGAGCTGTACCAGAA，TGF-β1-R GAACCCGTTGATGTCCACTT、18srRNA引物：18srRN A-F CCTGG ATACCGCAGCTAGGA、18srRNA-R GCGGCGCAATACGA ATGCCCC（上海生工生物科技有限公司合成）。人IL-32、Bcl-2、BAX、TGF-β1抗體（北京博爾邁生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 重組腺相關病毒載體rAAV2-IL-32的病毒滴度測定：應用CMV探針（地高辛標記）點雜交方法檢測病毒液中rAAV2-IL-32的物理滴度（以病毒基因組數/ml，vg/ml表示）。準確定量質粒SV40，用稀釋緩沖液（梯度稀釋后）點樣尼龍膜上；待測病毒液rAAV2-IL-32樣品用DNase I和RNase稀釋，終濃度均為1μg/ml，于37℃消化1h，提取rAAV2 DNA， 100℃水浴5min變性，置于冰浴中。按試劑盒說明以一定比例稀釋緩沖液后點膜。按Boehringer Mannheim公司試劑盒說明書，再進行預雜交、雜交、洗膜、顯色。通過計算IL-32的拷貝數、再乘以與其雜交信號強度一致的病毒液樣品的稀釋倍數而得出rAAV2-IL-32的物理滴度，滴度計算公式：滴度（v.g./ml）= 雜交信號對應的拷貝數×2×稀釋倍數。

1.2.2 細胞培養：KFs的培養：含10%小牛血清的DMEM培養基，置于CO2培養箱內（37℃，5% CO2）培養。當細胞鋪滿瓶底時進行消化、傳代。實驗用3～4代細胞。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察rAAV2-IL-32感染效果：按照常規方法擴增腺相關病毒，分別以感染復數（MOI）103，104，105的比例感染KFs，通過熒光顯微鏡觀察感染48h后EGFP的表達，并以此選擇最佳感染濃度。

1.2.4 RT-PCR方法檢測IL-32轉錄表達：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，收獲1×105細胞，離心沉淀，抽提總RNA，按照試劑盒說明書進行逆轉錄，用IL-32的引物做PCR檢測，PCR的反應條件為94℃ 4min，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 1min，35個循環，72℃ 10min。

1.2.5 MTT法檢測rAAV2-IL-32對KFs增殖的影響：以10%小牛血清DMEM配成濃度為1×105/ml的細胞懸液，加入96孔培養板；每孔100μl，37℃、5% CO2孵育過夜；分別以感染復數（MOI）103，104，105的比例加入IL-32及腺相關病毒空載體作為對照（每組設3個復孔），37℃、5% CO2孵育72h后，每孔加MTT（5mg/ml）10μl；繼續孵育4h后加入溶解劑10%SDS，1%HCL（1mol/L），每孔100μl，37℃孵育，6h后在多功能酶標儀上測吸光度（570nm）值，并計算相對增殖率。

1.2.6 RT-PCR方法檢測rAAV2-IL-32感染KFs后的Bcl-2、BAX、TGF-β1的表達：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，收獲1×105細胞，離心沉淀，提取總RNA，按照試劑盒說明書作逆轉錄。用IL-32的引物做PCR檢測，PCR的反應條件為：94℃ 4min，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 1min，35個循環，72℃ 10min。

1.2.7 蛋白質印跡檢測rAAV2-IL-32感染KFs后的Bcl-2、BAX、TGF-β1的表達：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，收集細胞，PBS洗滌2次，加入裂解緩沖液，冰上放置30min。然后在4℃、15 000×g離心15min，收集樣品并與上樣緩沖液一起煮沸10min，進行SDS-PAGE電泳；再將凝膠蛋白轉印到硝酸纖維膜上，經5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗室溫孵育2h，TBST緩沖液洗3次，再加入辣根過氧化酶標記的二抗孵育1h，ECL發光液作用1min后以化學發光凝膠成像系統掃描記錄實驗結果，并進行定量分析。

1.2.8 統計分析：實驗數據采用SPSS15.0統計學軟件分析，計量資料結果用均數±標準差（x±s）表示；兩組間差異比較用t檢驗，三組間差異比較用方差分析和q檢驗。P>0.05差異無統計學意義，P<0.05差異有統計學意義。

2結果

2.1 重組腺相關病毒載體rAAV2-IL-32的病毒滴度測定（表1），病毒滴度為 5.2×1011 v.g./ml。

2.2IL-32在KFs中的表達

2.2.1rAAV2-IL-32感染KFs后的熒光表達：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，熒光顯微鏡觀察細胞，rAAV2-IL-32在感染復數（MOI）105時感染效率達50%以上（圖2、3）。說明重組腺相關病毒轉染成功，感染效率達到實驗要求。

2.2.2RT-PCR結果：rAAV2-IL-32感染KFs經RT-PCR驗證在570bp處出現高表達電泳條帶，而腺相關病毒空載體組則未出現電泳條帶，表明rAAV2-IL-32在KFs中過表達（圖4）。

2.3 rAAV2-IL-32對KFs增殖能力的影響：腺相關病毒空載體和rAAV2-IL-32按照不同的感染復數濃度感染KFs，72h后，用MTT檢測方法分析KFs相對增殖率（圖5）。結果顯示：rAAV2-IL-32組比對照組細胞增殖率差異有顯著性（P<0.05），表明體外轉染IL-32基因后可抑制KFs生長，且有濃度依賴性。

2.4 RT-PCR方法檢測rAAV2-IL-32感染KFs后Bcl-2、BAX、TGF-β1的表達（表2）。

2.4.1Bcl-2、TGF-β1的表達結果：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，結果顯示： Bcl-2、TGF-β1在KF組的表達水平明顯高于正常皮膚組（P<0.05）；Bcl-2、TGF-β1在KF-IL-32組的表達水平明顯低于KF組和KF-EGFP組（P<0.05），說明體外感染rAAV2-IL-32 能顯著降低Bcl-2、TGF-β1在KFs中的表達水平。

2.4.2BAX的表達結果：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，結果顯示：BAX在KF組的表達水平明顯低于正常皮膚組（P<0.05）；BAX在KF-IL-32組的表達水平明顯高于KF組和KF-EGFP組（P<0.05），說明體外感染rAAV2-IL-32能顯著升高BAX在KFs中的表達水平。

2.5 蛋白質印跡檢測rAAV2-IL-32感染KFs后Bcl-2、BAX、TGF-β1的表達：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，蛋白質印跡法檢測顯示Bcl-2、TGF-β1的表達水平降低，BAX的表達升高（圖6），表明體外感染rAAV2-IL-32可上調BAX蛋白的表達，同時下調Bcl-2、TGF-β1蛋白的表達。

3討論

近來許多研究表明，瘢痕疙瘩的形成可能與基因的結構、功能或表達異常有關，但其調控機制尚不明確。瘢痕疙瘩在臨床表現及組織病理學改變等方面與良性腫瘤有某些相似之處，研究發現腫瘤相關基因及細胞因子在瘢痕疙瘩與正常皮膚中存在表達差異[6]，它們在瘢痕疙瘩的發生發展中起著重要作用。人IL-32基因定位于染色體16p13.3上，含有8個小外顯子，跨長約5kb。人IL-32 mRNA長為1.2kb，在免疫組織中表達增強[7]。目前發現，IL-32一共有6種剪接變異體[11]：IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε和IL-32ζ蛋白。IL-32的主要生物學功能：①誘導產生炎癥細胞因子[4]；②是重要的調節細胞增殖與凋亡的基因：在T細胞中，IL-32的大量表達可誘導細胞凋亡[8]；③在自身免疫性、炎癥性疾病里起重要作用[9]：IL-32可誘導多種細胞因子的產生，同時與多種炎癥性疾病密切相關；是一種前炎癥反應細胞因子，與疾病的嚴重性程度相關，在適應性免疫應答和固有性免疫應答中發揮作用。

在瘢痕疙瘩組織中及體外培養的KFs中均發現了細胞增殖調控及細胞凋亡方面的異常。研究顯示凋亡相關基因的表達異常與瘢痕疙瘩的形成相關[10]。本課題組前期研究結果提示人IL-24基因在瘢痕疙瘩組織中的表達低下[11]。本研究發現人IL-32基因調控細胞凋亡機制與IL-24基因（腫瘤抑制基因）具有一致性，提示IL-32基因可作為病理性瘢痕基因治療的有效候選靶基因之一。

原癌基因Bcl-2有促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用，TGF-β1可促進瘢痕成纖維細胞的增殖與分化，從而參與病理性瘢痕的形成。與其相對應的細胞凋亡相關基因BAX則可促進瘢痕成纖維細胞凋亡。本實驗成功將人IL-32基因腺相關病毒載體導入到人KFs中，通過RT-PCR及蛋白質印跡檢測顯示：Bcl-2、TGF-β1在KF組的表達水平高于正常皮膚組；BAX的表達水平低于正常皮膚組。而Bcl-2、TGF-β1在KF-IL-32組的表達水平明顯低于KF組和KF- EGFP組；BAX在KF-IL-32組的表達水平高于KF組和KF- EGFP組。提示IL-32在mRNA和蛋白水平通過抑制Bcl-2、TGF-β1的表達或者同時提高BAX表達從而抑制瘢痕的增生。這有可能是IL-32基因抑制瘢痕疙瘩增生的機制之一。

本實驗僅研究了IL-32基因在體外實驗中對KFs部分細胞因子間的相互作用。而IL-32基因與其他細胞因子間的作用以及通過何種信號轉導途徑影響瘢痕凋亡，還有待進一步研究。

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[收稿日期]2012-09-21 [修回日期]2011-11-03

編輯/張惠娟