Hsp90α促進慢性難愈性創(chuàng)面愈合作用研究進展

王芳 栗勇 　蘇映軍

慢性難愈性創(chuàng)面，簡稱慢性創(chuàng)面，系指臨床治療4～6周以上的難愈合或不愈合創(chuàng)面。多由靜脈曲張、糖尿病、動脈炎、動脈硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腫瘤等引起。據(jù)統(tǒng)計，全世界約有1%的人口被持續(xù)性的創(chuàng)面問題所困擾，約5%的醫(yī)療費用花費在創(chuàng)面修復上。在美國，每年在慢性糖尿病創(chuàng)面愈合治療方面的費用已超過250億美元[1]。而我國，據(jù)統(tǒng)計僅糖尿病所致慢性創(chuàng)面患者就達4 000萬例。隨著人口老齡化和糖尿病、下肢靜脈潰瘍等發(fā)病率的不斷上升，難愈性創(chuàng)面的發(fā)生率也越來越高[2]；由于缺乏有效的治療，這將發(fā)展為嚴重的社會問題，因此探索創(chuàng)面愈合機制及尋找一種高效經(jīng)濟的治療方法顯得十分迫切。

正常創(chuàng)面愈合過程可大致分為三個階段：局部炎癥反應階段、細胞增殖分化階段和組織塑形重建階段。創(chuàng)面愈合的病理生理機制是一個動態(tài)有序且復雜的過程，但在各種系統(tǒng)或局部因素作用下，這種有序的過程被破壞，導致了慢性難愈創(chuàng)面的發(fā)生。造成此種破壞的因素歸納起來主要有以下五點：①營養(yǎng)不良；②組織灌注不良和缺血再灌注損傷；③細菌負荷、感染和壞死組織存留；④糖尿病；⑤細胞衰老。在上述因素的影響下，創(chuàng)面修復能力被削弱，而以損傷因素為主導，最終導致了難愈創(chuàng)面的形成。

1創(chuàng)面愈合的治療方法

迄今為止，在慢性難愈性創(chuàng)面的治療方面，臨床上尚缺乏非常有效的方法。19世紀初發(fā)明的封閉負壓引流技術（vacuum assisted closure， VAC）至今仍為臨床所用，但該治療方法的禁忌證廣泛，治療效果也存在較多爭議[3]；創(chuàng)面應用敷料治療技術，目前已有各種成熟的產(chǎn)品，但其對面積大，損傷程度較深的創(chuàng)面，效果仍然有限[4]；高壓氧治療，該方法雖已被證實能夠有效改善創(chuàng)面生長環(huán)境，促進肉芽組織的形成，然而其體積龐大，成本較高，臨床療效一般，且禁忌證較多；基因治療雖然取得了一定成績，然而多數(shù)僅局限于細胞及動物實驗，且其安全性問題尚待研究[5]；干細胞移植雖然應用于動物正常創(chuàng)面可以加速愈合，但是應用于慢性創(chuàng)面的動物模型及臨床的效果卻并不理想且成本較高[6]；手術治療的效果并不確切，也為患者帶來較大的痛苦及負擔；而中醫(yī)復方藥具有多靶點多途徑的復合作用等特點，且價格低廉、使用方便、適用廣泛，但是其在創(chuàng)面愈合方面的作用機制卻未能得到科學深入的闡述而影響了它的推廣應用。

過去的30多年，血清中的生長因子被普遍認為是創(chuàng)面愈合的始動因素：絲裂原和運動因子，如：表皮生長因子/轉化生子因子 （EGF/TGF ），角質細胞生長因子（KGF），白介素-1（IL-1）等能夠促進角質形成細胞的遷移及上皮化而促進創(chuàng)面愈合；血小板源性生長因子（PDGF-BB）和/或血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等能夠誘導成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞遷移，促進創(chuàng)面纖維增生和新生血管形成[7-8]。自從1989年EGF第一次被報道用于創(chuàng)面愈合臨床實驗研究以來，許多生長因子也相繼用于創(chuàng)面愈合臨床實驗；研究報道大部分生長因子在創(chuàng)面愈合中都有作用[9-10]，最終卻只有PDGF-BB被美國FDA批準用于臨床治療[11-12]。然而，研究發(fā)現(xiàn)PDGF-BB用于創(chuàng)面治療療效低、花費高、副作用大等，臨床應用受限[13]。這表明血清中的生長因子可能并不是創(chuàng)面愈合中促進細胞遷移的來源，使得傳統(tǒng)的觀念認為生長因子是促進創(chuàng)面愈合的主要驅動力量受到質疑和挑戰(zhàn)[14]。

2Hsp90α與創(chuàng)面愈合

2.1 HSP90α的發(fā)現(xiàn)：胎牛血清常被用于創(chuàng)面愈合的各種細胞培養(yǎng)，但研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的細胞并不與胎牛血清真正的融合，在創(chuàng)面中也是懸浮于血清中。通過觀察胎牛血清及人血清對創(chuàng)面愈合所需的三類細胞即角質形成細胞、成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞的遷移作用比較，發(fā)現(xiàn)胎牛血清能夠同等地促進三類細胞的遷移；而人血清只能促進角質形成細胞的遷移，對成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞的遷移沒有作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)人血清中的TGF-β3 是導致其不能促進真皮細胞遷移的原因。由于血清中豐富的TGF-β3，生長因子如PDGF-BB等不能夠誘導成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，因此，臨床應用中效果不如體外實驗明顯。通過對損傷后創(chuàng)面中促使愈合的細胞及分子的研究，研究者發(fā)現(xiàn)了熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α， HSP90α），其不僅能夠同等地促進創(chuàng)面愈合所需三類細胞的遷移，更重要的是，即使在TGF-β3大量存在的創(chuàng)面中，HSP90α促進細胞遷移的作用并不受影響[15]。因此，HSP90α作為一個新奇的因子，成長了創(chuàng)面愈合研究領域的新觀念。

2.2 HSP90α及F-5的作用：體外研究表明在低氧等應激狀態(tài)下，角質形成細胞和成纖維細胞分泌Hsp90 至胞外，當這些分泌的Hsp90 迅速聚集達到一個μM的濃度時，會反過來促進細胞的遷移。在小鼠背部全層創(chuàng)面使用重組的HSP90α后，其促進創(chuàng)面愈合的速度比安慰劑快約60%，是PDGF-BB的3倍；而在糖尿病小鼠背部創(chuàng)面運用重組HSP90α后，糖尿病創(chuàng)面愈合的速度明顯優(yōu)于PDGF-BB。 HSP90α的作用在創(chuàng)面愈合過程中是必不可少的[16-18]。

從治療角度來說，蛋白中小片段的、穩(wěn)定且具有同樣效應的短肽由于具有高度特異性以及低耗能，因此，比全長的氨基酸片段更容易通過GMP生產(chǎn)管理，故不同長度的HSP90α的截短體也由此而生。通過體外實驗發(fā)現(xiàn)含有115個氨基酸（處于HSP90α的中間區(qū)域與鏈接區(qū)域）的截短體F-5，是目前與全長的HSP90α有同樣的促進細胞運動的最小的氨基酸片段。體內(nèi)試驗表明F-5加速創(chuàng)面愈合的速度優(yōu)于PDGF-BB， 并且主要是通過促進上皮化來實現(xiàn)的；而對于糖尿病創(chuàng)面F-5的作用優(yōu)勢更甚于普通創(chuàng)面，也優(yōu)于PDGF-BB；F-5能夠將糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的時間由35天縮短至14～18天，并且不是通過血管化或是創(chuàng)面的收縮完成[17]。

2.3 HSP90α及F-5的特性：HSP90α及F-5具有以下特性，因此其促進創(chuàng)面愈合的作用優(yōu)于生長因子 [17]：首先，HSP90α及F-5是一個公共的能動性因子；即HSP90α及F-5能夠同等地促進3種創(chuàng)面愈合所需的皮膚細胞（表皮角質形成細胞，真皮成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞）的遷移。皮膚受損后，首先角質形成細胞的橫向移動使創(chuàng)口閉合，之后成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞遷移至基底修復受損組織及重建血管。因此，一個理想的創(chuàng)面愈合因子應該具有募集創(chuàng)面愈合所需三類細胞的能力，由于創(chuàng)面愈合所需的三類皮膚細胞都能表達不同水平的LRP-1受體 [16]，所以，HSP90α具有此特性。而如果某個因子只能夠對某一類細胞起作用，其對創(chuàng)面愈合這個需要多種細胞參與的過程效果將明顯降低，如生長因子 PDGF-BB，只有成纖維細胞表面能夠表達PDGF受體，所以它只能促進成纖維細胞的遷移。假設體外研究結果與創(chuàng)面愈合過程相類似，那就說明PDGF-BB對表皮角質細胞的上皮化和真皮微血管內(nèi)皮細胞的血管化并沒有直接的影響；其次，HSP90α及F-5是一個TGF 抵抗因子；由于細胞表面作用的受體具有選擇性，PDGF-BB不能夠抵抗創(chuàng)面中TGFβ3的抑制作用刺激成纖維細胞遷移，因此，在臨床應用中效果并不明顯。然而即使在TGFβ3存在的情況下，HSP90α及F-5同樣能夠有效地促進三類細胞的遷移，但具體作用機制尚待研究；第三，HSP90α及F-5是一個高糖抵抗因子，各種類型的糖尿病都是以血液循環(huán)中慢性高血糖為特征，這也是糖尿病創(chuàng)面愈合延遲的主要原因之一[19]。在創(chuàng)面愈合過程中，缺氧誘導因子1α（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）是調(diào)節(jié)HSP90α分泌的一個關鍵因子，有報道說明高糖能夠損害HIF-1α的穩(wěn)定性 [20-21]。Cheng等[17]最近研究發(fā)現(xiàn)高糖能夠抑制低氧和血清刺激成纖維細胞遷移的作用，而HSP90α及F-5不僅能夠增強在正常血糖水平低氧促進細胞遷移的作用，而且可以拯救高糖狀態(tài)下低氧抑制培養(yǎng)的細胞的遷移。這說明HSP90α及F-5促進糖尿病創(chuàng)面的愈合是由于越過了高糖導致的HIF-1α的下調(diào)并啟動了細胞的遷移。

基于以上特性，一個新的創(chuàng)面愈合的程序被提出來，并且對驅動表皮和真皮細胞的遷移做出了說明：在受傷之前，皮膚中的HSP90α，TGF-β3和細胞的運動性是保持在最低限度的；受傷后數(shù)小時內(nèi)，角質形成細胞開始水平移動（可能是受到急性缺氧或是血清中TGF-α的誘導），此時，創(chuàng)緣的成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞由于血清中TGF-β的存在并不能立即向創(chuàng)面基底移動；遷移的角質形成細胞開始分泌HSP90α，當分泌的HSP90α達到100nM的閾值時[22]，即使在TGF-β存在的條件下，成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞開始從創(chuàng)緣周圍遷移至創(chuàng)基；最后角質形成細胞完全閉合創(chuàng)面，成纖維細胞修復受損組織，血管內(nèi)皮細胞重建新的血管。組織的重建和血管的新生需要幾月才能完成，因此，角質形成細胞分泌的HSP90α替代了血清中的生長因子，可能真正的募集真皮細胞進入創(chuàng)面的因子。

最后，Hsp90α及F-5是一個運動因子而非絲裂原（不能促進細胞的增殖） [23]，這是因為：①角質形成細胞的遷移在皮膚損傷后立即發(fā)生，而真皮細胞的遷移至少4天以后才能被監(jiān)測 [24] ；②當某個細胞正向著創(chuàng)面區(qū)域遷移時，這個細胞并不能同時增殖；局部受損組織所釋放的生長因子刺激表皮和真皮細胞的增殖將會被創(chuàng)面周圍的TGF-β家族細胞因子所抑制[15，17]；③在創(chuàng)面愈合過程中，細胞的遷移優(yōu)先于細胞的增殖。當創(chuàng)緣的細胞向基底遷移時，這些細胞給它們自己及其后的細胞留下了空間，當與前面移動的細胞失去接觸抑制作用后，后面的這些細胞才開始增殖。細胞增殖的刺激最可能來自于周圍沒有被損傷的血管中的生長因子，因為這些血管中的TGF-β水平很低甚至缺乏。增殖的細胞重新填滿遷移細胞留下的空間而完成創(chuàng)面愈合過程。因此，Hsp90α的作用是盡可能快地促進最初創(chuàng)口的關閉，預防感染及水分丟失，緩解外環(huán)境的應激。

3結語和展望

慢性難愈性創(chuàng)面是外科常見疾病，病因繁多、病理復雜，組織再生能力差，治療困難。HSP90α的發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的創(chuàng)面愈合觀念，為難愈性創(chuàng)面的治療提供了一個更有效、更安全的因子，對HSP90α的作用及其機制的進一步研究，會有利于我們更深入地了解創(chuàng)面愈合的相關機制，為難愈性創(chuàng)面的治療提供新的思路。

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[收稿日期]2012-08-20[修回日期]2012-10-08

編輯/李陽利