局部miR—126基因治療促進小鼠缺血后肢血管新生的觀察

曾淑紅 易成剛 郭樹忠

[摘要]目的：通過體外構建重組腺病毒miR-126，應用于小鼠缺血后肢腓腸肌局部治療，觀察miR-126對缺血局部具有促血管新生作用。方法：重組腺病毒miR-126包裝 、純化、滴度的鑒定；C57小鼠隨機分為A組（C57左側缺血后肢手術組）、B組（空病毒C57左側缺血后肢手術組）、C組（重組腺病毒miR-126 C57左側缺血后肢手術組）三組，制作小鼠缺血后肢模型，術后即刻將重組腺病毒miR-126和腺病毒各50μl局部注射于小鼠缺血左后肢腓腸肌。分別于3、7、14天各組（3只）取左后肢腓腸肌做HE染色、CD31免疫組化染色、western blot檢測Akt、ERK1/2、pAkt、pERK1/2蛋白水平以及實時定量PCR檢測等。結果：各種檢測結果顯示C組較A、B兩組血管內皮細胞增生明顯，新生血管數目計數明顯增多，miR-126表達水平明顯增高，尤其在第7天升高最為明顯，以及VEGF、bFGF等介導的IP3和MAPK信號通路中ERK1、pERK1、AKT和 pAKT蛋白水平表達明顯增高。結論：miR-126局部應用于缺血后肢，通過激活Akt、ERK1/2的相關通路，促進血管新生，利于缺血后肢功能恢復。

[關鍵詞]miR-126；缺血后肢；血管新生；Akt；ERK1/2；

[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）10-0-0

microRNA是新近發現的一類長約19-25個核苷酸的內源性微小RNA，通過與靶mRNA的5'或3'端的非編碼區互補結合而使靶mRNA翻譯抑制或降解[1]。 miR-126位于染色體9q34.3的宿主基因Egfl7（上皮生長因子-7）[2]，在內皮細胞中特異性高表達，調節內皮細胞生物功能的諸多方面，包括內皮細胞的增殖、遷移、細胞骨架的形成、毛細血管網的穩定以及細胞的存活等等，表明它是活體中維持功能性血管結構的前提，對血管新生起著至關重要的作用，展示了良好的應用前景[3-4]。

本實驗通過體外構建重組腺病毒miR-126，局部應用于小鼠缺血后肢，觀察其在局部表達情況的變化，以及促缺血局部血管新生的作用，從而及早、有效的促進缺血后肢功能的恢復情況，探索miR-126基因治療在臨床上應用的可行性。

1材料

1.1 實驗動物：C57小鼠，雌性，12周，購于第四軍醫大學實驗動物中心。

1.2 儀器：顯微外科手術器械、顯微外科顯微鏡、酶標儀、電泳電源、電泳器材、轉膜電源、半干轉器材、滾筒架、發光儀、熒光定量PCR儀、凝膠成像系統（美國UVP）、水平電泳槽、超凈工作臺、干燥消毒烤箱、紫外分光光度計、臺式離心機、低溫高速離心機。

1.3 試劑：CD31抗體（Abcam）、二抗（Elvision法）、DAB顯色液、裂解液、ERK1/2抗體、、AKT抗體、pERK1/2抗體、pAKT抗體、轉膜液、發光液（Santa Cruz）、麗春紅染料、封閉液、NC膜、電泳液、SDS凝膠試劑、GADPH、RT-PCR引物合成 （ABI，北京）、RNasin （Promega，美國）、M-MLV （Promega，美國）、SYBRR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，日本）。

2方法

2.1 重組腺病毒miRNA-126包裝 、純化、滴度的鑒定：根據mus-mir-126 的基因信息， 設計上、下游引物如下：

以小鼠基因組DNA為模板擴增mus-mir-126 基因；全基因合成mus-mir-126 基因至PES 載體上；小鼠mus-mir-126基因克隆至pacAd5 CMV-IRES-GFP 載體上；質粒擴增、鑒定及線性化；重組腺病毒的包裝；用滴定法測定重組腺病毒滴度。

2.2 實驗動物分組：C57小鼠隨機分為3組，每組12只：A組、C57左側缺血后肢手術組；B組、空病毒C57左側缺血后肢手術組；C組、重組腺病毒miRNA-126 C57左側缺血后肢手術組。

2.3 C57小鼠左后肢缺血模型的構建：在顯微外科鏡下，小鼠左側腹股溝處暴露股動脈深、淺支，近、遠端結扎，中間離斷，縫合傷口。

2.4 給藥方法：空病毒組、重組腺病毒miRNA-126組用1ml注射器對左后肢腓腸肌局部注射，滴度為1×109OPU/ml，各50μl，按組分籠喂養。

2.5 檢測指標：

2.5.1 大體觀察：各組0～14天末梢血運狀況的觀察。

2.5.2 組織學檢測：7天、14天分別取左后肢腓腸肌組織，進行HE 染色、血管內皮細胞的CD31 染色，計算血管數目、密度。

2.5.2.1 石蠟切片常規HE染色。

2.5.2.2 CD31染色（Elivision法）：選取5μm厚的石蠟切片，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，壓力鍋進行抗原修復，滅活內源性過氧化物酶30min，10%山羊血清封閉液37℃溫育15min，PBS沖洗，滴加稀釋兔抗鼠CD31一抗（Abcam 1：250）4℃過夜，PBS沖洗，滴加二抗37℃溫育30min，沖洗、滴加新鮮配制的DAB顯色液，蘇木素復染，中性樹膠封片，閱片。

2.5.3 實時定量PCR檢測：各組C57小鼠第3、7、14天處死（各組每次3只小鼠），取左后肢腓腸肌組織做miR-126基因水平檢測。RNA的提?。粚崟r定量熒光PCR反應上下游引物設計；取5ug RNA運用Promega MMLV逆轉錄酶及相關試劑進行逆轉錄反應，反應體系為20μl；取0.5μl RT產物 運用SYBR？ Premix Ex TaqTM （TaKaRa） 進行實時定量PCR反應；數據處理。

2.5.4Western blotting 檢測分析：各組C57小鼠第14天處死，取左后肢腓腸肌組織ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT蛋白水平檢測。取出-80℃冰箱中的組織，解凍，稱取約20mg左右的小鼠腓腸肌組織加入裂解液，離心，提取蛋白；蛋白定量（BCA法）；采用SDS凝膠試劑盒配制12%的分離膠和3%的濃縮膠，上樣，跑電泳，90V，130V，90min；使用半干轉的方法轉膜，從下至上超厚濾紙、NC膜、膠、超厚濾紙的順序組裝，設置25V，30min；麗春紅染色，封閉，將NC膜放入稀釋液配制的一抗ERK1/2（1：1000）、、AKT（1：1000）、pERK1/2（1：1000）、pAKT（1：1000）的試管（50ml）中，試管固定于滾筒架上4℃過夜，洗膜，加二抗，山羊抗兔二抗（1：2000，用于ERK1/2、AKT、pERK1/2、pAKT檢測），山羊抗小鼠二抗（1：2000，用于GAPDH檢測）室溫孵育1小時；配置發光液，在發光儀中發光，western分析軟件、統計軟件分析結果。

2.6 統計學方法：統計結果用SPSS13.0統計學軟件進行分析，以平均值±標準差表示，兩兩均數比較用t檢驗，多組均數比較用單因素方差分析。

3結果

3.1 重組腺病毒microRNA-126構建、純化、滴度測定：見表1。重組腺病毒包裝、擴增后，應用滴定法測定病毒的滴度（TCID50）。

病毒TCID50 為：T=101+d（9.5-0.5）=101+1×（9.5-0.5）=1.00×1010TC ID50/ml，換算為病毒的PFU 滴度為：T=1010-0.7=109.3=2.00×109（PFU/ml），用時稀釋成1.00×109（PFU/ml）。

3.2大體觀察：各組0～14天從外形皮色、皮溫及肌肉萎縮狀況觀察，三組0～7天差別不很明顯。7～14天A、B組較C組相對皮色淤青明顯、肌肉有輕度萎縮、后肢中段周經測量稍小，平均相差約0.5mm。

3.3組織學檢測

3.3.1 HE染色：第7天C組：低倍鏡下萎縮纖維中有再生肌纖維，無明顯新生血管；高倍鏡見內皮細胞腫脹明顯，有明顯的血管芽，個別有新生血管腔形成；A組：低倍鏡下肌萎縮明顯，高倍鏡見內皮細胞扁平，呈梭形；B組：低倍鏡下肌萎縮明顯，炎癥明顯，高倍鏡見內皮細胞扁平，呈梭形。圖1～3。

第14天C組低倍鏡血管肉芽組織增生，有大量新生血管增生，高倍鏡下血管內皮細胞腫脹、增生，有大量血管腔形成；A組低倍鏡有肌萎縮，未見明顯肉芽組織增生，高倍鏡有少量血管內皮細胞增生，少見新生血管形成；B組低倍鏡有肌萎縮，未見明顯肉芽組織增生，高倍鏡有少量血管內皮細胞增生，少見新生血管形成。圖4～6。

3.3.2 CD31免疫組化染色：第7天高倍鏡下C組較A、B組CD31標記的內皮細胞增生明顯，有血管芽形成，未見明顯新生血管腔。圖7～9。

第14天低倍鏡下C組較A、B組CD31標記的內皮細胞增生明顯，有大量血管芽形成及明顯多的新生血管腔形成。結果表明C組的標記CD31陽性的血管內皮細胞較A、B組明顯增多。圖10～12。

3.4 實時定量PCR檢測miR-126的表達水平：①Cr：重組腺病毒miR-126 C57小鼠右側后肢組；②陰：正常C57小鼠左后肢組；③A：C57小鼠左側缺血后肢手術組；④B：空病毒C57小鼠左側缺血后肢手術組；⑤Cl：重組腺病毒miR-126 C57小鼠左側缺血后肢手術組。圖13。

設陰性組3天的miR-126的表達量設為1，各組數據為相對表達量，即平均值±標準差。統計分析采用Student's t test。陰性組與Cr組在3day，7day，14day均無統計學意義（P>0.05）。陰性組與A、B、Cl組均有統計學意義（P<0.05）。A組與B組在3天，7天，14天均無統計學意義（P>0.05）。Cl組在3天，7天，14天與其他組均有統計學意義（P<0.05）。

結果表明A組缺血組織中的miR-126水平在術后明顯降低，尤其第7天，降低最明顯，14天有回升，但未及正常水平。C組術后miR-126水平呈上升趨勢，尤其是第7天達最高水平，14天水平有回落，但仍高于正常水平。這與組織學檢測的結果正好相符。Cr組的miR-126水平與陰性組相一致，說明體外重組腺病毒miR-126局部注射于小鼠缺血后肢，可以明顯增加缺血局部組織中miR-126水平的表達，而不影響其它部位miR-126的水平。

3.5 western blotting監測分析：見圖14。各組數據為相對表達量，即平均值±標準差。統計分析采用Student's t test（*P<0.05，**P<0.01）。

結果顯示C組較B組、A組中ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT的蛋白表達水平明顯增高。表明缺血組織局部被動高表達miR-126，可以明顯的增加ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT蛋白水平的表達，說明miR-126是激活了VEGF、FGF等生長因子介導的MAPK和PI3的信號通路。

4討論

組織移植是整形外科和燒傷外科等學科臨床上最常用的治療手段，移植組織術后存活的基本條件是在移植組織耐缺血時限之內及時重建血液循環，血運重建的時間和質量與移植組織的存活及存活質量有密切的關系。

臨床實踐中組織移植術后，移植的組織通過與受區重建血液循環而存活。通常較薄的組織（如皮片移植）和體積較小的組織（如少量的顆粒脂肪移植）比較容易建立血運而易于存活，而較厚的組織（如真皮下血管網皮片移植）和體積較大的組織（如大量脂肪注射、大塊的組織工程組織移植），往往因為不能在耐缺血時間內及時、有效的重建血液循環而不易存活，這也就是真皮下血管網皮片移植、大量脂肪移植等，目前在臨床廣泛應用中面臨的巨大難題，因此移植術后能否及時、有效的重建血運是提高移植組織存活率和存活質量的關鍵。另外，冠心病、腦梗死、肢端缺血性壞死等缺血性病變仍是臨床上十分常見的疾病，這些缺血疾病轉歸的關鍵也是及時、有效的重建血運。重建血運的重要途徑就是促進缺血局部的血管新生，改善缺血局部血供，利于缺血局部功能恢復。

血管新生主要是由于機體受到各種病理或生理上的刺激，如組織再生、缺血、缺氧，炎癥，以及腫瘤生長等因素，引起內皮細胞增殖、遷移、成熟等，從而形成新的血管。內皮細胞是維持血管系統的基本單位，也是新血管形成的前提、重要條件。

miR-126是近年來發現，在內皮細胞中特異性高表達，在轉錄后水平，調節功能性血管形成的重要因素。Fish J.E等[3]、Wang S等[4]的研究表明在胚胎發育過程中敲除 miR-126基因，由于引起血管內皮細胞功能異常，出現血管滲漏、內出血以及胚胎致死等。Coen van Solingen等[5]通過在活體外構建miR-126拮抗劑，單次大劑量通過靜脈用于左后肢缺血鼠中，檢測血管數目較對照組明顯減少，進一步證實了miR-126拮抗劑對血管形成和動脈生成有明顯的抑制作用。說明miR-126正常水平的維持是功能性血管形成的前提及重要的條件。

本實驗發現在小鼠缺血后肢中，miR-126的水平較正常后肢明顯降低，依此設想通過體外基因包裝技術被動提供缺血局部miR-126的表達水平，就可以促進缺血局部功能性血管新生，加快缺血局部功能的恢復。

本實驗設計通過體外以小鼠基因組DNA 為模板擴增mus-mir-126 基因，經重組腺病毒包裝、純化、滴度檢測，局部注射于小鼠缺血后肢的腓腸肌，結果顯示缺血局部miR-126的表達水平明顯提高，說明基因病毒包裝技術的成熟與有效，以及局部注射基因方法的可行性。

在本實驗中發現缺血局部被動高表達miR-126，不會對其他部位或組織中miR-126水平造成影響，從而確保了miR-126基因治療的安全性、高效性。

在本實驗中缺血局部高表達miR-126，可以通過激活VEGF、bFGF介導的MAPK（ERK1/2）和PI3（AKT）的信號通路，明顯的促進缺血局部的血管新生。AKT和ERK1/2是MAPK和PI3信號通路中的關鍵蛋白，ERK1/2、、AKT、pERK1/2、pAKT表達水平的明顯升高，說明MAPK和PI3信號通路的激活。在之前的研究中發現，spred-1[6]和PIK3R2（p85β）[7]是MAPK和PI3信號通路的抑制分子，同時也是miR-126的靶向mRNAs，miR-126在轉錄后水平，靶向的抑制或降解spred-1和PIK3R2（p85β）mRNAs[3-4]。所以缺血局部高表達的miR-126，靶向的抑制或降解spred-1和PIK3R2（p85β）mRNAs水平，解除其對MAPK和PI3信號通路的抑制，激活并促進MAPK和PI3信號通路的傳導，引起血管內皮細胞的增殖、分化、遷移及成熟等，促進缺血局部的血管新生，改善缺血局部的血供，利于缺血局部功能及早恢復。

miR-126還靶向抑制VCAM-1（血管細胞粘附分子1）mRNA[8]，VCAM-1是通過內皮細胞分泌的細胞粘附分子，而miR-126可以抑制內皮細胞表面VCAM-1的表達，減少炎細胞（主要是白細胞）與內皮細胞的粘附，減少局部炎癥作用的發生，降低并發癥，促進血管新生的作用。

對于miR-126機制的研究不斷深入，Stefania nicoli等[9]（2010）在斑馬魚的胚胎發育過程中，觀察到血流對于主動脈弓的血管形成非常重要，而且表明主動脈弓的血管形成是通過血流刺激、誘導的基因通路形成的，這種基因通路是機械敏感性鋅指轉錄因子klf2a誘導內皮細胞特異性microRNA-miR-126激活Vegf介導的信號通路，來促進主動脈弓的血管形成，且證明在斑馬魚胚胎的主動脈弓血管形成的生理發育過程中，klf2a是miR-126的上游分子。

雖然目前對于miR-126的研究，在血管新生、腫瘤[10-12]等方面已有不少發現，但有關機制方面仍存在許多未知。本實驗通過體外構建重組腺病毒miR-126，缺血局部注射基因，觀察到缺血局部miR-126的表達水平明顯提高，缺血局部血管新生作用明顯的增強，這使將來過渡到臨床應用成為可能。

[參考文獻]

[1]Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004， 116（2）：281-97.

[2]Iva Nikolic，Karl-Heinz Plate，Mirko HH Schmidt.EGFL7 meets miRNA-126： an angiogenesis alliance[J].Angiogenes Res，2010，2（1）：9.

[3]Fish JE，Santoro MM，Morton SU，et al.miR-126 regulates angiogenic signaling and vascular integrity[J].Dev Cell，2008，15（2）：272-284.

[4]Wang S， Aurora AB， Johnson BA， et al.The endothelial specific microRNA miR-126 governs vascular integrity and angiogenesis[J].Dev Cell，2008，15（2）：261-271.

[5]Coen V.S，Leonard S，Roel B，et al.Antagomir-mediated silencing of endothelial cell specific microRNA-126 impairs ischemia-induced angiogenesis[J].Cell Mol Med.2009，13（8A）：1577-1585.

[6]Wakioka T，Sasaki A，Kato R，et al.Spred is a Sprouty-related suppressor of Ras signalling[J].Nature，2001，412（6847）：647-651.

[7]Ueki K，Fruman DA，Yballe CM，et al.Positive and negative roles of p85α and p85β regulatory subunits of phosphoinositide 3-kinase in insulin signaling[J].Biol Chem，2003， 278（48）：48453-48466.

[8]Harris TA，Yamakuchi M，Ferlito M，et al.Micro RNA-126 regulates endothelial expression of vascular cell adhesion molecule 1[J].Proc Natl Acad Sci，2008，105：1516-1521.

[9]Stefania N，Clive S，Paul W，et al.MicroRNA-mediated integration of haemodynamics and Vegf signalling during angiogenesis[J].Nature，2010，22，464（7292）：1196-1200.

[10]Negrini M，Calin GA.Breast cancer metastasis：a microRNA story[J].Breast Cancer Res， 2008，10（2）：203.

[11]Wang X，Tang S，Le SY，Lu R，et al.Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive MicroRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth[J].PLoS ONE，2008，3（7）：e2557.

[12]Miko E，Czimmerer Z，Csanky E，et al.Differentially expressed microRNAs in small cell lung cancer[J].Exp Lung Res，2009，35（8）：646-664.

[收稿日期]2012-06-25 [修回日期]2012-08-21

編輯/張惠娟