大麻素受體CB2在機械牽張力介導的人牙周膜細胞成骨分化中的作用

錢紅 趙亞 胡靜 閆英劍

[摘要]目的：研究大麻素II型受體（cannabinoid receptor II， CB2）在機械牽張力介導的人牙周膜細胞中的表達以及成骨分化中的作用。方法：體外培養人牙周膜細胞，構建細胞-機械牽張力加載模型，施加不同大小的機械牽張力，采用Real-time PCR和細胞免疫熒光化學技術檢測CB2在人牙周膜細胞中mRNA和蛋白的表達。用堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測機械牽張力介導的細胞ALP活性。結果：對人牙周膜細胞施加不同大小的機械牽張力24h，CB2 mRNA的表達隨機械牽張力的力值增大而顯著性增加（P<0.05），在18%拉伸應變率作用下表達量最高（P<0.05），此時CB2蛋白的表達顯著增加。加入CB2激動劑HU-308后，施加18%拉伸應變率的機械牽張力作用于人牙周膜細胞24h，ALP活性顯著性增加（P<0.05）。結論：CB2在人牙周膜細胞中的表達與機械牽張力的力值具有相關性。在機械牽張力作用下，大麻素受體CB2與其配體結合能夠促進人牙周膜細胞的成骨分化，從而在正畸牙槽骨改建中發揮重要作用。

[關鍵詞]大麻素II型受體；機械牽張力；成骨分化；牙周膜細胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）10-0-0

正畸治療中，矯治器所施加的機械力首先作用于牙齒，然后傳導至牙周膜，牙齒一側的牙周膜受到牽張力，牙槽骨形成；另一側牙周膜受到壓力，牙槽骨吸收，從而發生牙槽骨改建，使錯位的牙齒在牙槽骨內發生移動，到達正常位置[1-2]。牙周膜細胞是機械力的直接效應細胞，具有成骨樣細胞表型，受到機械牽張力作用后首先發生成骨分化，進而形成牙槽骨，在正畸牙槽骨改建中發揮著極其重要的作用[3-4]。因此研究牙周膜細胞在機械牽張力作用下的成骨分化過程，對于深入了解正畸牙槽骨改建機制具有重要意義。但是，目前對于機械牽張力作用下牙周膜細胞發生成骨分化的機制仍未闡明。我們前期的研究證實：人牙周膜細胞表達大麻素II型受體（cannabinoid receptor II， CB2），CB2與其配體（CB2激動劑）結合能夠促進人牙周膜細胞的成骨分化[5]，這提示我們：CB2很可能參與了機械牽張力作用下人牙周膜細胞的成骨分化過程。本實驗進一步研究CB2在機械牽張力介導的人牙周膜細胞成骨分化中的作用。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：DMEM培養基 （Hyclone，美國）；胎牛血清 （FBS，Gibco，美國）；胰蛋白酶 （Gibco，美國）；FITC標記山羊抗兔IgG （Santa Cruz Biotechnology， 美國）；HU-308（Cayman Chemical， 美國）； SR144528（Cayman Chemical， 美國）；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒 （南京建成生物制品公司）；CO2細胞培養箱 （Forma Scientific，美國）；YJ-875型超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；倒置相差顯微鏡及照像系統 （Olympus，日本）；Flexercell Strain Unit （Flexcell International，美國）；ABI 7500 Fast Real-time PCR System （Applied Biosystems， 美國）。

1.2人牙周膜細胞的體外培養和鑒定：取11～14歲青少年因正畸拔除的牙周健康的雙尖牙。采用組織塊法原代培養人牙周膜細胞，取第2代細胞爬片，用免疫組化SP法進行波形絲蛋白和角蛋白染色，進行來源鑒定。證明細胞為間葉來源后，取第3～5代細胞用于實驗。

1.3人牙周膜細胞的體外加力：采用細胞機械牽張力加載裝置Flexercell Strain Unit，構建人牙周膜細胞-力學加載模型。對細胞加載24h的機械牽張力，力值分別為0%、6%、12%、18% 拉伸應變率，頻率為6循環 / min，每循環包括5s拉伸，5s松弛。

1.4 Real-time PCR檢測機械牽張力作用下CB2 mRNA在人牙周膜細胞中的表達

1.4.1 總RNA提取：在彈性培養皿中加入lml Trizol，吹散，收集細胞于1.5ml Ep管內，震蕩30s后加入0.2ml氯仿，劇烈搖動30s，室溫3min，12 000g，4℃離心，l5min，吸上層無色水相，移入另一EP管中（約0.5ml）。加等體積異丙醇，-20℃，30min。12 000×g，4℃ 離心，10min。在管底部可見微量RNA 沉淀。棄上清，加75%乙醇lml，振蕩。7 500×g，4℃ 離心，10min。棄上清，用濾紙吸取殘留液體，室溫干燥 5～10min。沉淀溶于20μl DEPC水，取1μl加入79μl DEPC水，測OD260/OD280計算濃度與純度，-70℃保存。逆轉錄合成cDNA。

1.4.2 Real-time PCR實驗：引物設計見表1，Real-time PCR 根據QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒手冊進行。反應混合液（25L）預先在95℃放置l5min以激活熱啟動Taq酶，然后95℃變性30s，95℃退火5s，60℃延伸30s，共40個循環。其中內參l8s-rRNA同樣進行Real-time PCR擴增。采用△ △Ct方法計算每個樣品目的基因與內參的比值作為目的基因的mRNA表達。

1.5 細胞免疫熒光化學技術檢測機械牽張力作用下CB2 蛋白在人牙周膜細胞中的表達：將長有細胞的玻片放于玻璃器皿內，冷丙酮固定，0.5%Triton-X 100的PBS透化，正常山羊血清封閉，滴加用抗體稀釋液稀釋的兔抗人CB2一抗（1：100），濕盒中4℃過夜，漂洗后滴加用FITC標記的山羊抗兔二抗（1：500），暗室中在室溫孵育30～60 mim，PBS徹底漂洗，90%甘油封片。熒光顯微鏡下進行觀察。

1.6 用ALP試劑盒檢測加入CB2激動劑HU-308和/或CB2抑制劑SR144528后，機械牽張力介導的人牙周膜細胞ALP活性：取生長狀態良好的細胞，2.5g/L 的胰蛋白酶消化后，用含50ml/ FBS的DMEM培養液配成單細胞懸液，以每孔103細胞接種到96孔板上，每孔體積為200μl，次日去除未貼壁死細胞，換含10ml/L FBS的DMEM培養液，分別加入10-7M CB2激動劑HU-308和/或1μM CB2抑制劑SR144528，然后施加18%拉伸應變率的機械牽張力24h，采用ALP試劑盒檢測ALP活性。

1.7 統計分析：采用SPSS12.0統計軟件包對數據進行單因素方差分析和t檢驗，P<0.05認為有顯著性差異。

2結果

2.1 CB2 mRNA在人牙周膜細胞中的表達：Real-time PCR結果見圖1。結果顯示，施加不同大小的機械牽張力作用于人牙周膜細胞24h，CB2 mRNA的表達隨機械牽張力的力值增大而顯著性增加（P<0.05），在18%拉伸應變率作用下表達量最高（P<0.05）。

2.2 CB2 蛋白在人牙周膜細胞中的表達：細胞免疫熒光化學技術檢測結果見圖2。結果顯示，施加18%拉伸應變率的機械牽張力作用于人牙周膜細胞24h，CB2 蛋白的表達顯著增加。

3.3 機械牽張力作用下，人牙周膜細胞ALP活性：如圖3所示，加入CB2激動劑HU-308后，施加18%拉伸應變率的機械牽張力作用人牙周膜細胞24h， ALP活性顯著性增高（P<0.05）；然后再加入CB2抑制劑SR144528，ALP活性顯著性降低（P<0.05）。

3討論

內源性大麻素（canabinoid，CB）系統包括大麻素受體、其內源性配體以及大麻素合成、降解酶。生物體內存在大麻素I型受體（cannabinoid receptor I，CB1）和大麻素II型受體CB2，這兩型大麻素受體都屬于G蛋白耦聯受體。CB1主要分布在中樞神經系統，包括大腦與脊髓；而CB2主要分布于外周[6]。近幾年來骨代謝研究領域最重要的發現之一是證實骨組織內存在著內源性大麻素系統。CB2與其配體（CB2激動劑）結合通過以下機制維持骨量：①直接促進成骨細胞分化及功能表達；②直接抑制破骨細胞分化及功能表達，或通過抑制成骨細胞表達的破骨細胞分化因子（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）來間接抑制破骨細胞[7]。

我們前期的研究結果證實：人牙周膜細胞表達大麻素受體CB2。CB2與其配體結合能夠促進人牙周膜細胞成骨標志物的表達，從而證明： CB2能夠促進人牙周膜細胞的成骨分化[5]。本實驗進一步研究了機械牽張力對CB2在人牙周膜細胞中表達的影響以及CB2在機械牽張力介導的人牙周膜細胞成骨分化中的作用。

本實驗發現：CB2在人牙周膜細胞中的表達與機械牽張力的力值具有相關性。這說明CB2是一種對機械牽張力敏感的基因，那么它在機械牽張力介導的牙槽骨改建中究竟發揮什么作用？進一步的實驗發現：在機械牽張力作用下，CB2與其配體（CB2激動劑）結合能夠增加ALP活性。ALP廣泛分布于體內幾乎所有器官，是骨形成所必需的酶，通過水解磷酸酯、破壞礦化抑制劑及作為鈣結合蛋白和磷酸基的轉運子而促進礦化。作為生物礦化和成骨樣細胞的一種特征性標記，其活性的高低可反映相應細胞向成骨方向分化的趨勢。以往的研究發現：人牙周膜細胞在機械牽張力作用下ALP活性升高，成骨標志物表達增加[3-4]。因此，本實驗結果說明：在機械牽張力作用下，CB2與其配體結合能夠促進人牙周膜細胞的成骨分化，從而在正畸牙槽骨改建中發揮重要作用。目前國內外的研究僅限于大麻素系統對骨代謝的調控作用和牙周炎時促進牙周組織愈合的作用[7-10]，關于CB2在機械牽張力作用下人牙周膜細胞成骨分化中的作用尚未見報道。我們將繼續深入地進行研究，以期為完善正畸臨床理論以及相關骨生物力學理論作出貢獻。

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[收稿日期]2012-08-25[修回日期]2012-09-21

編輯/張惠娟