富血小板血漿在皮膚抗衰老中作用機制的研究進展

樊明山

預防和延緩皮膚衰老已成為美容研究的熱點。自從20世紀80年代開展了生長因子在組織修復中的作用研究后，特別是外源性生長因子的應用，著眼于提高機體自身的自我修復能力，從某種意義上，使皮膚抗衰老的治療也在觀念上有了更新。富血小板血漿（Platelet-rich Plasma ，PRP）凝膠應用于面頸部皮膚抗衰老的方法，就是這一觀念的體現。本文就PRP凝膠在皮膚抗衰老方面的作用機制研究綜述如下。

1皮膚衰老的機制及病理生理改變

1.1皮膚衰老的機制：皮膚衰老通常分為內源性衰老和外源性衰老，前者主要表現為自然衰老形式，后者主要因環境因素，如：紫外線輻射、吸煙、風吹及接觸有毒化學物質引起，但主要表現為“光老化”形式。

內源性皮膚衰老的過程很大程度上受多種特異基因的影響。同種生物內部微小的基因變化（如：單核苷酸多態性）可以影響該個體在各個年齡段的老化速度；老化的哺乳動物細胞有三種表型：①細胞不可逆的抑制DNA的合成；②細胞凋亡的抵抗；③不同功能表達的變化。Spiring等[1]實驗證實了DNA復制與衰老相關，他們在皮膚成纖維細胞培養物中發現了DNA合成抑制因子，它通過抑制細胞DNA合成引起細胞復制速度減慢，錯誤率上升，最終導致基因突變。同時，細胞αDNA變異或缺損的修復能力下降，從而導致細胞衰亡。另有研究證明，皮膚衰老與真皮膠原蛋白的含量和性質有關，隨著年齡的增長，控制DNA合成的抑制物增多，致使rRNA、tRNA、mRNA含量逐漸下降，蛋白合成進一步減少，由于蛋白降解亦相應減少，結果膠原量減少并老化[2-3]。外源性皮膚衰老以日光中的紫外線（UV）所造成的皮膚“光老化”最為顯著，照射早期，成纖維細胞由合成膠原纖維轉而合成彈力纖維；中期網狀纖維增生，新合成膠原纖維增多，又因UV引起真皮炎性浸潤，浸潤的單核巨噬細胞、中性粒細胞釋放蛋白水解酶，使成熟膠原進一步減少，整體膠原由Ⅰ型向Ⅲ型膠原轉變。另外，真皮彈力纖維吸收UV發生彈力纖維蛋白變性，纖維增粗，聚集成團。這樣，皮膚就呈現“光老化”的增生表現，晚期則呈現“萎縮”狀態[4-6]。

在皮膚衰老的外源性因素中，除UV外，外傷、感染、空氣污染、吸煙等均可造成皮膚大分子損傷，被稱為“衰老因素”。其共同的機制是直接或間接地誘導機體微循環炎癥系統的某個環節，引起炎癥反應，又打破微循環炎癥系統的自身平衡，最終導致細胞外變性分子堆積，造成皮膚細胞的隨機損傷[7]。

1.2皮膚衰老的病理生理改變：皮膚衰老是在漫長的生命過程中日積月累逐漸形成的，從時間順序上內源性衰老和外源性衰老疊加在一起，很難將兩者準確區分，其病理生理改變也基本一致。

在病理方面，皮膚表皮角質形成細胞生長緩慢，皮膚增生能力減退，皮膚變薄。真皮中成纖維細胞合成膠原纖維，彈力纖維，氨基多糖和蛋白多糖等基質減少，真皮萎縮，皮膚松弛，過度伸展后出現皺紋，深部毛細血管擴張，慢性真皮缺血，皮膚暗啞無光澤或呈灰黃色。在生理方面，表皮更替速率下降，防護性屏障功能減退，角質形成細胞產生白介素和其他細胞生長因子能力下降，表皮修復角質層所需的時間隨年齡增加而延長，皮脂腺功能減退，皮脂分泌減少，DNA修復能力下降，皮膚免疫功能降低，皮膚內防護性酶（SOD，谷胱甘肽過氧化物酶）活性降低，對自由基清除能力下降，促進皮膚衰老[8]。

2富血小板血漿（PRP）

PRP是通過離心自體全血而得到的高濃度血小板血漿。其中富含多種生長因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、轉化生長因子（TGF-β）、胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、血管內皮生長因子（VEGF）等。它的血漿成分中存在三種蛋白質：纖維素、纖粘連蛋白及親玻粘連蛋白。這些生長因子對促進細胞的增殖與分化，增加膠原合成能力，促進基質合成和沉降及組織的形成有著極其重要的作用，并且生長因子之間有良好的協同作用[9-10]。

2.1 PRP的制備及激活： PRP的制作就是將抽取于自體靜脈的全血通過離心的方法從中提取高濃度血小板血漿。目前制作的方法很多，按其制備程序，可分為一次離心法，二次離心法和三次離心法，大量實驗證明：一、二次離心法PRP 的提取率最高，臨床應用也最廣。其基本原理是根據血液中各組分的沉降系數不同，在第一次離心后將血液分成三層，最底層是沉降系數最大的紅細胞，最上層是上清層，交界處有一薄層肉眼不易區分，即富血小板層。二次離心的原理在于，第一次離心后，棄去上清層或紅細胞層，然后改變離心力再次離心，使更多的血小板分離出來。不同離心力，離心次數和離心時間制作的PRP中血小板和生長因子濃度不相同[11]。Landesberg[12]以不同的離心力和離心時間二次離心制作PRP，發現如果離心力大于250g，會導致血小板破壞過多。如果第一次離心時間少于5min，得到的PRP中血小板濃度與全血無顯著性差異，建議第一次離心后棄去紅細胞，兩次離心均采用200g力離心10min較好，PRP血小板濃度為全血的6.17倍。而Marx[13]認為，PRP的制作第一次需要高速離心，第一次離心后，紅細胞和上清交界面以下2mm血小板濃度最高，棄去上清后再低速離心，這樣可以更好地提取血小板[14]。

目前多數學者認為，第一次低速離心后，吸取全部上清和交界面下的一部分紅細胞層于另一支離心管，再次以高速離心，所得PRP中血小板回收率較高。Sonnleither[15]第一次離心160g力離心20min后，發現交界面下6mm血小板濃度最高，并且第二次離心400g力離心15min后，檢測試管底部的血小板濃度超過2000 000/nl，達正常血小板濃度的近10倍。無論以何種方法分離PRP，都須進一步制備成PRP凝膠以激活濃縮的血小板后，α顆粒才能釋放高濃度的各種生長因子，發揮組織修復作用。PRP凝膠是PRP與氯化鈣和凝血酶混合而成的一種具有粘性的膠狀凝塊，目前已被證實最好的PRP激活劑是由氯化鈣和凝血酶混合制成，在使用前，PRP與激活劑按一定比例搖晃均勻，即成PRP凝膠，可直接注射植入所需局部進行治療。另外，血小板在體外非常脆弱，在血液中流失很快，在注射過程中由于注射針頭太小，推擠壓力過大會損壞血小板外衣而破壞血小板。PRP凝膠相當于給血小板穿上了一層外衣，可保護血小板在體外不受損害，防止血小板的流失，使血小板在局部長時間停留，并分泌高濃度生長因子，PRP凝膠還有一定的可塑性，有利于填充塑形的美容治療。

2.2 PRP在皮膚組織損傷修復中的作用機制：PRP凝膠植入衰老受損的皮膚組織后，多種高濃度生長因子被激活，引起一系列皮膚細胞內反應，抵抗DNA合成抑制因子，促發相應的基因表達而起作用。

PDGF是由血小板的α顆粒和巨噬細胞合成的糖蛋白，主要通過與成纖維細胞、內皮細胞和巨噬細胞上的α受體結合，激活衰老受損局部細胞的有絲分裂，增加細胞基質產物，使再生細胞增多[16]。研究證實在受損傷部位的成纖維細胞和角質細胞內有PDGFmRNA 的表達。因此，PDGF能夠增加損傷部位成纖維細胞向肌纖維細胞轉化，使損傷組織膠原蛋白的合成量增加，促成組織的生長修復[17-18]。

TGFβ也是一種糖蛋白，主要由血小板和巨噬細胞產生。TGFβ參與體內許多炎癥反應和組織修復，是體內多功能的基礎抗炎細胞因子。TGFβ的含量與膠原的合成、損傷愈合的時間，損傷愈合組織的張力等有一定的關聯。有研究表明，組織損傷后的炎癥前期，局部相關的細胞因子有所增加，而TGFβ水平暫時下降，膠原沉積減少。TGFβ既可直接作用于成纖維細胞對細胞外基質的蛋白合成，也可使體外低濃度的TGFβ刺激成纖維細胞合成大量的膠原基質，從而促進損傷修復[19]。EGF（表皮生長因子）是血小板分泌的PDGF激活巨噬細胞和成纖維細胞，由活化的巨噬細胞和成纖維細胞產生。EGF與受體結合后發揮活性，EGF受體（EGFR）幾乎在所有細胞都有表達，但以表皮細胞最為豐富。皮膚損傷后，局部使用PRP凝膠后可釋放EGF，EGF不僅加速表皮生長，而且有增加基質形成和結締組織收縮的作用。動物切割傷模型已證實外用EGF能加速表皮生長，并增加傷口愈合張力[20]。血管內皮生長因子包括VEGFA、B、C、D、E和胎盤生長因子，具有促進血管新生及增強血管通透性的作用，是軟組織中微血管修復中的重要生長因子。FGF能促進中胚層和神經外胚層的細胞的有絲分裂，多種組織的發生發展均受到FGF的影響。能促進細胞運動，使細胞從G0期向G1期轉化、增殖，產生大量的膠原和成纖維細胞，構成組織外基質，促進組織的修復。IGF，包括IGF1和IGF2。IGF2研究的較少，IGF1可以與PDGF協同作用增加表皮和內皮的再生[21]。PRP血漿成分中含有的纖維素，纖粘連蛋白及親玻粘連蛋白將血小板釋放的生長因子聚集在局部發揮作用。還能作為新生細胞和組織的支架促進衰老皮膚的修復。

在實驗與臨床研究中，PRP在皮膚衰老方面的研究報道少之又少，但對皮膚損傷愈合修復作用的研究報道還是較多的，在這些報道中，均證實PRP表現出良好的修復作用。王悅等[22]用PRP體外培養人真皮纖維細胞，實驗結果表明：PRP能加速靜止（G1/G0）細胞進入S期進行DNA復制，從而促進細胞數量的增加。PRP對hDFbs有促進增殖作用。袁霆等[23]用PRP凝膠修復皮膚缺損，PRP組皮膚更顯成熟，皮膚真皮層纖維排列較對照組整齊。Ceovetti用PRP治療皮膚潰瘍，與對照組相比，發現PRP能很好地在傷口處形成肉芽組織，促進傷口上皮組織完全再生[24]。Marx用PRP凝膠和凝血酶作對照修復全層皮膚缺損，結果顯示，術后第7、14、20、30天，PRP凝膠組傷口的上皮形成率分別為91%、95%、100%、100%，而凝血酶組上皮形成率為4%、15%、38%、69%。PRP凝膠的傷口愈合遠遠高于對照組。根據皮膚衰老的機制和病理生理改變，這些生長因子具有影響老化速度、逆轉抑制DNA合成、抵抗細胞衰亡和加強組織細胞功能表達的重要作用。由此推斷，PRP與皮膚抗衰老之間呈正相關關系。

3富血小版血漿在皮膚抗衰老中的展望

PRP中含有多種高濃度的生長因子，由于PRP來源于自體全血，各生長因子間的比例與體內正常比例相符，使生長因子之間有最佳的協同作用，在一定程度上彌補了單一生長因子激活修復不佳的缺點，且不會出現外源性生長因子的免疫排斥，也不會有異體移植中存在的傳播疾病的危險。PRP在激活劑的激活下形成凝膠狀，可以保護血小板在注射植入中受損，防止血小板流失，使血小板在局部長時間分泌生長因子，保持較高的生長因子濃度，避免了外用液態生長因子外擦易流失、易蒸發和作用時間短的缺點。PRP凝膠在皮膚抗衰老修復中，不僅承載了多種高濃度生長因子，而且因為它呈凝膠狀，具有一定的可塑性，對皮膚皺紋、凹洞、皮膚松弛等均有良好的填充支撐作用。另外，PRP的血清中還含有大量的細胞粘合蛋白：纖維素、纖粘連蛋白和親玻粘連蛋白，為皮膚修復提供了良好的3D立體結構支架，還可以收緊松弛的皮膚。

因此，利用PRP技術把多種活性生長因子直接植入衰老肌膚，激活衰老細胞的功能表達，促進皮膚組織細胞增殖、分化和重新排列，是探索皮膚抗衰老的新方法。隨著對PRP中各類成分及其相互作用的進一步研究和理解，這一方法在皮膚抗衰老中有著廣闊的應用前景。

[參考文獻]

[1]spiering AL，Pereira-smith OM，Smith JR.Correlat ion between comple mentation group for immortality anb DNA synthesis inhibitors[J].Exp Cell Res，1991，195（2）：541-545.

[2]Isobe K，Ito S，Hosaka H，et al.Nuclear-recessive mutations of fa ctorsinvolued in mit ochondrial tra nslation are responsible for age relate d respire-tion deficiency of humam skinfibroblasts[J].J Biol Chem，1998，273（8）：4601-4606.

[3]Chung JH，seo JY，Choi HB，et al.Modulation of skin collagen metabolism in aged and photoaged human skin in vivo[J].J Invest Dermatol，2001，117（5）：1218-1224.

[4]Fisher GJ，Datta SC，Tajwar HS，et al.Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism[J].Nature，1996，379（6563）：335-339.

[5]Trautinger F.Mechanisms of photodamage of the skin and its functional couseouuences forskin ageing[J].Clin Exp Dermatol，2001，26（7）：573-577.

[6]Bemeburg M，Plettenberg H，Krutmann J. Photoaging of human skin.Photodermatol Photoimmunol[J].Photomed，2000，16（6）：239-244.

[7]Giacomoni PU， Rein G.Factors of skin ageing share common mechanisms[J].Biogeron-tology，2001，2（4）：219-229.

[8]王家璧.如何延緩皮膚衰老.見朱文元，陳力.2005美容皮膚醫學新進展[M].北京：人民衛生出版社，2005：8-15.

[9]Weibrich G， Kleis WK，Hafner G，et al. Growth factor levels in the plateletrich plasma andcorrelations with donor age sex，and platelet count [J].J Craniomaxillofac Surg，2002，30：97-102.

[10]Robiony M，Polini F，Costa F，et al.Osteogenesis distraction and plateletrich plasma forbone restoration of the severely atrophic mandible：preliminary results[J].J Oral Maxillofac Surg，2002，60：630-635.

[11]袁霆，張長青.骨組織與軟組織修復作用中富血小板血漿制作及其原理[J].中國臨床康復，2004，8：7939-7941.

[12]Landesberg R，Roy M，Glickman RS.Quantification of growth factor levels using a simplified method of plateletrich plasma gel preparation [J].J Oral Maxillofac Surg，2000，58：297-300.

[13]Marx RE.Platelet rich plasma（PRP）： What is PRP and what is not PRP[J]？Implant Dent，2001，10：225-228.

[14]Marx RE，Carlson ER，Eichstaedt RM，et al.Plateletrich plasma： Growth factor enhancement for bone grafts [J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Raido Endod，1998，85：638-646.

[15]Sonnleitnerg D，Huemer P，Sullivan DY. A simplified technique for producing platelet-rich plasma and platelet concentraoral bone grafting techniques ： a technical note[J].Int JOral Maxillofac Implants， 2000，15：879-882.

[16]Eppley BL，Woodell JE，Higgin J.Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma：implications for wound healing [J].Plast Reconstr Eurg ，2004，114：1502-1504.

[17]Corrral C，Siddiqui A，Wu L，et al.Vascular endothelial growth factor is more important than basic fibroblastic growth factor during chemic wound healing [J].Arch Surg，1999，134：200-205.

[18]Horner A，Bord S，Kemp P，et al. Distribution of plateletderived growth factor （PDGF）A chain m RNA ，protein ，and PDGFalapha receptor in rapidly forming hunman bone [J].Bone，1996，19：353-362.

[19]Appleton L，Wound Healing： Future directions[J].Drugs，2003，6（11）：10-67.

[20]刑幫榮，利天增，卞徽寧.表皮生長因子與堿性成纖維細胞生長因子促進創面修復比較研究[J].中華燒傷雜志，2003，19（6）：340-343.

[21]Landesberg R，Roy M，Glickman RS.Quantification of growth factor levels using a simplified method of platetrich plasma gel preparation [J].J Oral Maxillofac Surg，2000，58：297-300.

[22]王悅，馬英智，朱著喆，等.富血小板血漿對體外培養條件下人真皮纖維細胞增殖能力的影響[J].吉林大學學報（醫學版），2011，37（1）：84-88.

[23]袁霆，張長青，陸男吉，等.富血小板血漿修復皮膚缺損的實驗研究[J].中華創傷骨科雜志，2008，10（7）：651-654.

[24]Crovetti G，Martinelli G，Issi M，et al.Platelet gel for healing cutaneous chronic wounds[J].Transfus Apheresis Sci，2004，30：145-151.

[收稿日期]2012-07-24[修回日期]2012-08-21

編輯/李陽利