揭秘化妝品安全性評價技術（十一）

通常消費化妝品無需擔心生殖和發育毒性的問題，但是近年來塑化劑、雙酚A等具有潛在生殖毒性的化合物引起的安全事件頻繁發生，使消費者對于長期使用化妝品的安全性越來越擔憂。一方面是化妝品質量參差不齊，消費者擔心各種非法添加和禁限用物質的超標使用，另一方面，受制于傳統評估方法的局限，人們對大量新化合物的長期慢性毒性根本來不及評估，因認識不足而加劇這種擔擾。因此，開發低成本高通量新的體外方法并與體內動物實驗整合運用可提高化妝品原料生殖與發育毒性的安全性評估與科學認知。

生殖是使種族延續的各種生理過程的總稱，包括配子（精子與卵子）發生、交配、卵細胞受精、著床、胚胎形成與發育、胎仔發育、分娩和哺乳等階段。生殖毒性指的是一種物質在繁殖周期的任何一個階段中所產生的毒副作用，既包括外源物質對親代生殖功能的影響，也包括對子代發育過程的有害影響。如今年以來愈演愈烈的塑化劑事件，導致危機的鄰苯二甲酸酯類就屬于對生殖發育的各個階段均有可能產生危害瓦特的一類化合物。研究表明鄰苯二甲酸酯類在人體和動物體內發揮著類似雌性激素的作用，可干擾內分泌，影響男性生殖系統的功能，嚴重的會導致睪丸癌。動物實驗表現為腎臟和睪丸重量減輕、流產、胚囊植入率降低、多臟器發育畸形。鄰苯二甲酸酯類普遍存在于化妝品中，指甲油的鄰苯二甲酸酯含量最高，很多化妝品的芳香成分也含有該物質。化妝品中的這種物質會通過女性的呼吸系統和皮膚進入體內，如果過多使用，會增加女性患乳腺癌的幾率，還會危害到她們未來生育的男嬰的生殖系統。因此，日化工業的高速發展不能忽視可能日趨嚴重的生殖和發育毒性危害。

生殖毒性的動物實驗

化學物的生殖發育毒性有兩個顯著的特點：一是生殖系統較機體的其他系統對化學物的毒作用更為敏感，二是損害作用不僅影響接觸化學物質的母體本身，還可影響其后代。鑒于哺乳類動物繁殖過程的復雜性，對繁殖過程的各個方面進行毒理學分析都是必須的，包括致畸性、內分泌干擾、母細胞突變、生育受損等。為了檢測化學物質對生殖周期內不同靶細胞/器官的毒副作用，OECD發布了8個試驗指導，這些指南大多數是動物實驗方法。2009年OECD認可了TG 455（雌二醇受體轉錄試驗），這是首個發布的生殖毒性試驗替代方法。還有3項體外試驗方法已完成驗證，進入法規認可程序。發育和生殖毒性的試驗標準還見于美國試驗和材料學會（ASTM）、美國環保局（USEPA）等的方法指南中。

傳統的生殖毒性檢測以動物試驗為主，包括分娩前發育毒性研究（OECD TG 414）、一代動物毒性研究（OECD TG 415）、二代動物毒性研究（OECD TG 416）、生殖毒性/發育毒性篩選檢測（OECD TG421）、重復劑量毒性研究結合生殖毒性/發育毒性篩選檢測（OECD TG 422），以及2009年發布的Hershberger試驗（TG411）和目前正在討論中的發育神經毒性試驗（TG426）。我國列入各類商品（藥品、食品、藥妝品、化學品）毒性測試指南的標準方法均來源于OECD。完整的生殖毒性研究應包括成年動物從受孕到子代性成熟的各個發育階段接觸受試物的反應。測試時間應連續通過一個完整的生命周期，即從親代受孕到子一代受孕。最常用的三段生殖毒性試驗由生育力和早期胚胎發育毒性試驗、胚體—胎體毒性試驗（致畸試驗）和出生前后發育毒性試驗（圍產期毒性試驗）三部分組成。對于人類反復接觸的化學物，如食品添加劑、農藥、環境污染物及某些化妝品原料等，僅做三段生殖毒性試驗是不夠的，應進行多代生殖試驗。

2008年OECD提出了一項新的試驗指南，稱為延長一代生殖毒性研究，用于代替一代和二代動物毒性研究（OECD 415，416）以及其它特定發育毒性研究（OECD 426，414）。試驗設計體現了3R法規的要求，更加靈活和有效，優化了實驗過程和檢測指標，增加了發育神經毒性和免疫毒性的評價，減少了動物使用。

體外替代方法的研究策略

鑒于哺乳類動物繁殖過程的復雜性，試圖通過體外系統模擬整個繁殖周期來檢測某種化合物的生殖毒性還不可能。因此，將整個繁殖過程分成數個連續的生物學部分，分別對其進行單獨或聯合研究，可最大化鑒定出某種物質的靶細胞、組織或器官。根據這一思路，已建立了許多有前景的體外模型和方法。例如內分泌干擾物的篩查方法、報告基因檢測方法、計算機輔助精子檢測方法等。這些體外方法的組合應用有助于生殖毒性的安全性評價和機制研究。

1. 雄性和雌性繁殖力和受精方面

目前研發的方法覆蓋了許多毒性作用終點，如睪丸支持細胞和生精細胞毒性，卵泡發生（FBA檢測），生殖細胞成熟，精子運動性和形態學（CASA檢測），精子DNA損傷（ReProComet檢測），甾體生成（FBA和粒層細胞檢測），內分泌系統干擾（MELN，CALUX、PALM試驗），授精（小鼠和牛體外授精檢測），著床前胚胎發育（小鼠和牛體外著床前檢測），胎盤形成（絨毛膜和周邊細胞培養，胎盤表面灌注，滋養層細胞檢測），子宮功能（內膜、血管膜、基質細胞和移植物檢測）等。目前，比較成熟的體外試驗方法約有15項，涉及生殖和發育毒性的多個方面。

2. 著床方面

由于化學物質可能損傷著床過程，進而造成其它生殖系統異常，因此，著床毒性作用研究是生殖毒性的重要方面。體外方法主要集中于對離體人組織和組織移植物的研究，其中最重要的靶組織是子宮內膜，其次是毛細血管內皮細胞。此外還可利用人胎盤進行化合物的轉運研究。

3. 胚胎發育方面

現有的方法是全胚胎培養（W E C）、小鼠胚胎干細胞試驗（EST）和微團試驗。小鼠EST試驗以分化為博動的心肌細胞為檢測終點。歐洲一些科學家提出了用人的胚胎干細胞（hES）用于檢測神經發育毒性物質的替代方法，避免了因毒性反應的種間差異引起的化學物錯誤分類。關于著床機制的數學模型也取得了進展，QSAR模型開發用于預測化學物的胎盤轉移、可能的內分泌紊亂活性作用和代謝方式等。毒性基因組學結合功能性指標（如表型錨定）用于評價受體介導以及分化過程中基因表達變化的相關性和一致性。

已驗證的生殖和發育毒性替代方法

20 03年，三項胚胎毒性替代試驗通過了歐洲替代方法驗證中心（ECVAM）的驗證，這些實驗是：用于檢測胚胎毒性的全胚胎培養試驗（WEC）、微團培養試驗（MM）和胚胎干細胞試驗（EST）。2009年雌二醇受體轉錄試驗被OECD認可為指南TG 455，用于內分泌干擾物篩查。這些方法不僅可用于篩選試驗，還可用于發育機制的研究，或作為試驗策略的組成部分，或與整體動物試驗相結合，或與其它體外試驗相結合，提供有價值的資料，減少實驗動物使用。

1. 雌二醇受體轉錄檢測

雌二醇受體（ER）是一個誘導靶基因轉錄的轉錄因子，利用ER的這一特性，將雌二醇受體調控的DNA序列與容易檢測的報告基因連接起來，這樣可以直接對雌激素類化合物進行篩選。如MCF-7、Hela、HepG等細胞均可作為轉染載體成為檢測細胞。體外雌二醇受體轉錄檢測（TAs）主要用來鑒定在體內具有激動劑或拮抗劑效應且能夠影響雌二醇活性的化合物。2009年被OECD認可的指南455使用來自人的宮頸癌并經穩定轉染的細胞系hERa-HeLa-9903，細胞暴露于非細胞毒性濃度的受試物20～24小時以誘發報告基因的產生，每個試驗同時檢測4種參考化學物質，強雌激素（17-β雌二醇）、弱雌激素（17-α雌二醇）、極弱雌激素（17-α-甲基睪酮）和陰性對照（皮質甾酮）。熒光素酶活性的測定采用液閃儀。如果誘發的最高反應相當或超過陽性對照（1 nM 17-α-雌二醇）反應的10%則可判定為陽性物質。

2. 胚胎干細胞試驗（EST）

Laschinski等于1991年將ES細胞用于體外致畸實驗研究，通過比較化合物對ES細胞和小鼠成纖維細胞的細胞毒性，對致畸物的胚胎毒性進行評估。Heuer等于1994年首次將ES細胞的分化過程用于胚胎毒性的檢測。1997年德國動物試驗替代方法評價中心（ZEBET）Spielmann等首次建立了利用小鼠細胞系（成纖維細胞3T3和胚胎干細胞D3），確立了兩種細胞三個檢測終點的胚胎干細胞實驗法。之后，經過方法優化，2003年完成全部驗證過程，被ECVAM認可為替代動物胚胎毒性試驗的方法，該方法廣東檢驗檢疫局已將其轉化為行業標準并用于日常檢測。

3. 全胚胎培養試驗（WEC）

來源于小鼠、大鼠和兔等哺乳類動物的胚胎培養可用于檢測具有發育毒性的物質。大鼠全胚胎培養是從孕期第9～10天大鼠子宮取出胚胎，剝去Reichert膜，放入培養液中加入受試物，在含O₂、CO₂和N₂環境中旋轉培養。觀察胚胎發育情況，記錄胚胎存活，檢測胚芽、卵黃囊直徑、體節和體長等情況。以胚胎的心跳和血液循環是否存在作為胚胎存活的指標；以卵黃囊直徑、顱臀長和頭長、體節數和胚胎重作為胚胎生長發育的指標；根據Brown評分對器官形態分化作出評價。該方法可用于篩查化學物的發育毒性、探討其劑量反應關系和作用機制。

4. 微團培養

微團培養（MM）比全胚胎培養簡單得多，胚胎肢芽細胞可取自雞、兔或大、小鼠，細胞一般分離自器官形成中期胚胎的肢體或頭部組織。制成單細胞懸液后，以高密度接種培養，通過分析受試物暴露后細胞分化情況，對確定的毒理學終點進行檢測。微團培養模型可用于體外觀察細胞生長發育和分化，探索外源性化合物的致畸作用、細胞毒性作用及作用機理研究。

生殖和發育毒性的替代方法

1.計算機輔助精子檢測

計算機輔助精子檢測（CASA）是通過觀察化學物質對牛精子細胞的毒副作用，評估化學物對雄性生殖力的影響。試驗前先進行劑量范圍確定試驗，然后計算IC50（與對照相比，精子總的運動性下降50%的化學物濃度），還包括對精子的生育能力、生存能力、活力、速率、活動、精液形態學等檢測指標作實時分析。CASA方法類似于男性的臨床生殖體檢，系統可自動得出系列參數，如曲線速度、直線速度、平均路徑速度、精子頭側擺幅度、平均移動角度等，用于檢測結果描述和判定。

2.睪丸間質細胞毒性試驗

睪丸間質細胞（Leydig細胞）分布于生精小管之間的疏松結締組織中，其主要功能是分泌睪酮。睪丸Leydig細胞分泌睪酮受到丘腦－垂體－性腺軸的調節。研究表明，外源化學物質會直接損傷萊迪希細胞影響睪酮分泌。運用體外培養的Leydig細胞，檢測受試物作用后睪酮分泌量，該方法可作為實驗策略的組成單元，用于雄性生殖毒性的篩查和機制研究。

3.睪丸支持細胞毒性試驗

睪丸支持細胞（Sertoli細胞）是生精小管的主要細胞，對精子的發生非常重要，支持細胞能合成和分泌多種活性蛋白質和多肽因子，如抑制素、激動素、雄激素結合蛋白等。體外培養的Sertoli細胞，用不同濃度的化學物作用，檢測細胞活性和功能變化，可用于評價化學物對睪丸支持細胞的毒性作用。可用兩種細胞系統進行試驗，大鼠原代Sertoli細胞和Sertoli細胞系（SerW3）。細胞在37℃培養形成單層，直接將不同濃度的受試物加入細胞培養液中孵育2～24小時。孵育結束后吸出培養基，試驗終點包括細胞毒性（MTT法）、培養液中抑制素B水平測定（ELISA法）、計算EC50的值、判斷化學物對Sertoli功能的影響。

4.顆粒細胞甾體生成試驗

顆粒細胞甾體生成試驗用于檢測雌性生殖毒性，細胞可選用永生化的小鼠顆粒細胞系NT-1和變異株NT-1- hAROM（表達人芳香化酶基因），研究受試物對顆粒細胞甾體生成水平的影響。如檢測對孕酮生成的影響，可將NT-1細胞與不同濃度受試物孵育，免疫法測定上清液中孕酮含量，貼壁細胞進行細胞毒性測定（MTT檢測）。如檢測對雌二醇生成的影響，可將NT-1-hAROM細胞與芳香化酶的底物雄烯二酮共孵育，酶聯免疫法測定培養液中雌二醇的產量，貼壁細胞進行細胞毒性測定（MTT檢測）。

5.卵泡培養檢測

卵細胞的生長和發育依賴于其周圍支持細胞的健康與發育狀況（即卵泡的形成）。在卵泡的漫長生長過程中，其組成部分在各個發育階段對化學損傷都是非常敏感的，這些損傷使卵細胞質量下降，可能導致卵細胞減數分裂異常、受精失敗或胚胎發育不良。卵泡檢測（FBA）利用體外生長的卵泡試驗系統模擬卵巢形態學特征，將其暴露于化學物，通過形態學、生物化學和功能指標檢驗分析化學物對卵泡發生、甾體形成和卵子發生的影響。可用于對卵巢功能具有抑制作用或激活作用的化學物的篩查，用于內分泌干擾物的篩查，以用于化合物干擾雌性生殖和受精能力的作用機制研究。可供檢測的試驗終點很多，如檢測卵泡存活、分化和反應性（排卵感應性）；檢測雄烯二酮/睪酮、雌二醇和孕酮水平；檢測卵子產量、核成熟度和發育能力等。

6.芳香化酶測試

芳香化酶具有將雄性激素轉化成雌性激素的功能，卵巢和胎盤中該酶活性很高，而大部分的殺蟲劑和黃體類似物都有抑制芳香化酶的活性。體外芳香化酶檢測（Aromatase tests）通過測量芳香化酶對標記的雄烯二酮的代謝能力，判斷受試物是否干擾芳香化酶的活性，可用于篩選環境干擾物質。目前有兩種體外檢測系統，分別是JEG-3和JAR絨毛癌細胞系。此外，還可以運用人類胎盤微粒體的體外亞細胞手段檢測芳香化酶的活性。

7.雌激素受體結合試驗

雌激素受體結合試驗用于檢測能夠與雌二醇受體（ER）結合的化合物。雌二醇受體是屬于核激素受體超家族的轉錄調控蛋白，其在調控轉錄活化和/或抑制雌二醇應答基因方面發揮重要作用。雌二醇受體結合試驗可檢測雌激素激動劑和拮抗劑，但不能將二者區分。雌二醇受體體外競爭結合實驗是通過定量檢測受試物和17β-雌二醇與雌激素受體的競爭性結合能力，檢測受試物是否能與ER結合發揮雌激素作用或干擾正常雌激素活性。雌激素受體結合試驗可作為實驗策略的組成部分，替代子宮增重動物實驗。

8.雄性激素受體結合試驗

雄性激素受體結合試驗是設計用來檢測待測底物與雄性激素受體（AR）的親和力。雄激素受體屬于核激素受體超家族的一種轉錄調控蛋白，與甾體類激素受體家族的成員高度同源，這些成員包括黃體激素、糖皮質激素和鹽皮質激素的受體。5α雙氫睪酮（DHT）是雄激素受體的天然配體，一些外源化學物質可能通過模擬或阻斷DHT發揮雄激素受體介導的內分泌干擾作用。如果外源化學物質的空間結構與DHT相似，就可能與雄激素受體結合或干擾DHT與雄激素受體的結合，從而導致正常生殖生理過程的紊亂。有些化學物可直接與雄激素受體結合，阻斷DHT引發的細胞內過程，成為DHT拮抗劑。雄性激素受體親和力檢測能夠檢驗出激動劑和拮抗劑，但不能區分兩者。該試驗方法可單獨運用或作為試驗策略的組成部分。

9.雄性激素受體轉錄檢測

與雌二醇受體轉錄檢測（TAs）一樣，雄性激素受體轉錄檢測主要用來鑒定在體內具有激動劑或抗結劑效應而能夠影響雄激素活性的化合物。這些檢測方法都是以基因工程細胞系為基礎，檢測受雄性激素調控的報告基因產物（例如熒光素酶）。試驗過程與雌二醇受體轉錄檢測類似，成熟的方法經驗證后有望通過OECD的認可。

結語

隨著工業化的發展，人們的日常生活已被各種化學物質包圍，越來越多的具有內分泌干擾毒性或生殖發育毒性的化學物質被科學實驗證實，如雙酚A、鄰苯二甲酸酯類、壬基酚、尼泊金酯等常見于化妝品的物質。因此，在科學合理使用化學物質的同時，也應加強對這些物質可能存在的生殖毒性進行研究，特別是研發和應用快速、特異、敏感和高通量的方法。

可喜的是近年來國內外對這個領域越來越重視，國際社會加快了有效的體內或體外方法的標準化進程。此外，尚有不少體外檢測方法有望在3-5年內轉化成為預測外源物質生殖發育毒性的標準方法。當然也應認識到人類生殖發育過程的極端復雜性，有一些毒理學作用，如生殖行為、分娩、出生后的機能發育和促性腺激素的分泌的檢測，即使是體內動物實驗也沒有統一的標準。因此，人類的生殖過程中，哪一個靶器官和生殖生理機制對化學物的損傷較為敏感，以及哪一個合適的體外模型能覆蓋這一敏感范圍，都必須進行評估和達成共識。只有那些科學性和相關性明確的方法才有進一步開發和驗證的價值。

致謝：本項目得到廣東省科技攻關項目的資助（2009B060300013）