水果及其制品中果膠含量的比色法測定條件優化

摘 要：為研究水果及其制品中果膠測定方法，以半乳糖醛酸為標準物質，對硫酸-咔唑比色法測定水果及其制品中果膠含量的比色條件如吸收波長、咔唑-無水乙醇溶液用量、硫酸用量、顯色溫度、顯色時間、顯色后穩定時間等進行了優化和系統研究。結果表明，最佳顯色條件為在1.0 mL濾液中，加入0.25 mL 0.1%咔唑-無水乙醇溶液，迅速加入5.0 mL硫酸，在85 ℃水浴中加熱20 min，自來水浴中冷卻，顯色后1.5 h內在525 nm波長條件下測定。在此條件下，標準曲線線性范圍廣、相關性良好，精密度和準確度高，均符合相關標準要求。

關鍵詞： 果膠； 比色法； 硫酸； 咔唑

中圖分類號：Ｓ６６ 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０（２０12）０2－0302－０6

Study on the colorimetry determination conditions of pectin in fruits and derived products

PANG Rong-li1， ZHANG Qiao-lian2， GUO Lin-lin1， FANG Jin-bao1*， XIE Han-zhong1， LI Jun1， LUO Jing1， WU Feng-kui1

（1Zhengzhou Fruit Research Institute， CAAS/ Monitor Test Center of Fruit and Nursery Stock Quality， the Ministry of Agriculture， Zhengzhou， Henan 450009 China； 2Department of Landscape Horticulture， Xuchang Vocational Technical College， Xuchang， Henan 461000 China）

Abstract: In order to research the determination method of pectin content in fruits and derived products， coloring conditions of sulfuric acid-carbazole colorimetry including absorption wavelength， amount of carbazole-ethanol solution and sulfuric acid， temperature， reaction time， and stabilization time after coloring were optimized using galacturonic acid as standard substance. The results showed that the optimum coloring conditions were adding 0.25 mL 0.1% carbazole-ethanol solution and adding 5.0 mL sulfuric acid quickly to 1.0 mL filtrate， water bathing for 20 min at 85 ℃， cooling down quickly with running tape water bath， and measuring at 525 nm wavelength within 1.5 h after coloring. Under the conditions， it had wide linear range standard curve， good correlation， high precision and accuracy，and were in line with relevant standards.

Key words: Pectin； Colorimetry； Sulfuric acid； Carbazole

果膠廣泛分布于水果、蔬菜等植物中，未成熟果實內的原果膠在細胞壁內與纖維素和半纖維素結合在一起[1]，不溶于水。當果實成熟時，原果膠變為可溶性果膠[2]，能溶于水，但不溶于乙醇和乙醚。新鮮水果、植物的根、葉和綠莖中果膠含量特別豐富，由于含有親水基團，果膠與水有強大的結合力，是有力的凝膠化劑，廣泛應用于食品、制藥和化妝品等行業[3]。要從植物中分離出天然果膠難度大，因此，傳統的果膠定量測定都采用間接方法，以測定果膠水解后生成的各種產物的含量為基礎，然后轉換為果膠含量，主要有重量法、容量法、比色法[4-6]。近年來，又陸續出現了高效液相色譜法（HPLC）[7]、氣相色譜法（GC）[8]、流動分析法[9]等。其中重量法操作繁冗、不穩定、回收率低，容量法測定時，若樣品中有顏色則不容易確定滴定終點，應用范圍也受到限制，而HPLC、GC和流動分析法都要求用特定的檢測儀器，并且運行成本較高。目前，已有關于比色法對果膠含量進行測定的研究報道[10-11]，但沒有針對水果及其制品中果膠的測定方法標準。我們按照國家有關測定方法標準的要求，對測定和顯色條件進行了試驗，以期為制定水果及其制品中果膠物質的測定方法標準提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

標準物質：半乳糖醛酸（分析純）。

試驗樣品：香蕉；獼猴桃；桃；甜櫻桃；橙汁；葡萄汁。

試劑：無水乙醇（優級純）；氫氧化鈉（分析純）；硫酸（優級純，與咔唑-無水乙醇溶液不應產生顏色反應）；咔唑（分析純）。

儀器：水浴振蕩器；離心機；分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 方法原理 用無水乙醇沉淀試樣中的果膠，在堿性條件下，經水解后生成半乳糖醛酸，后者在硫酸中與咔唑試劑發生縮合反應，生成紫紅色絡合物，該絡合物在525 nm處有最大吸收，其吸收值與果膠含量成正比，以半乳糖醛酸為標準物質，標準曲線法定量。

1.2.2 樣品預處理 稱取1.0 g~5.0 g（精確至0.001 g）試樣于50 mL刻度離心管中，加入少量濾紙屑，再加入35 mL約75 ℃的無水乙醇，在85 ℃水浴振蕩器中加熱10 min，充分振蕩。冷卻，再加無水乙醇使總體積接近50 mL，在4 000 r·min-1的條件下離心15 min，棄去上清液。在85 ℃水浴中用67%乙醇溶液洗滌沉淀，離心分離，棄去上清液，此步驟反復操作，直至上清液中不再產生糖的穆立虛反應為止，保留果膠沉淀A。同時做試劑空白試驗。

1.2.3 果膠提取液的制備 將果膠沉淀A用去離子水全部洗入100 mL容量瓶中。加入1.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液5.0 mL，用水稀釋至刻度，混勻。至少放置15 min，并不時搖蕩。過濾，保留濾液B，用于比色測定。

1.2.4 標準系列配制 以1 000 mg·L-1的半乳糖醛酸溶液為標準儲備溶液，制備系列質量濃度為0.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 mg·L-1的標準使用溶液。

1.2.5 測定 移取1.0 mL濾液B于25 mL玻璃試管中。另分別移取1.0 mL各個濃度的半乳糖醛酸標準系列溶液于玻璃試管中。于試樣及標準溶液中各加入0.25 mL 0.1%咔唑-無水乙醇溶液，產生白色絮狀沉淀，不斷搖動試管，再快速加入5.0 mL硫酸。立刻將試管放入85 ℃水浴振蕩器內加熱20 min，取出后放入自來水浴中使之迅速冷卻，在1.5 h時間內用分光光度計在525 nm波長處測量其吸光度，繪制標準曲線比較定量（按上述方法同時做空白試驗，用空白調0）。

1.2.6 結果計算 樣品中果膠含量以半乳糖醛酸質量分數ω計，單位為g·kg-1，按公式（1）進行計算：

ω=（1）

式中： ρ—濾液B中半乳糖醛酸質量濃度，單位為mg·L-1；V—果膠沉淀A定容體積，單位為mL；m—試樣質量，單位為g。

1.3 顯色條件試驗

設吸收波長（360~700 nm）、0.1%咔唑-無水乙醇溶液用量（0.0~1.0 mL）、硫酸用量（1.0~9.0 mL）、顯色溫度（40~100 ℃）、顯色時加熱時間（0~40 min）、冷卻方式（室溫自然冷卻、自來水浴快速冷卻）、顯色后穩定時間（0~105 min）等為顯色條件試驗。

1.4 準確度與精密度試驗

以香蕉、獼猴桃、桃、甜櫻桃、橙汁、葡萄汁等為試材，對方法的準確度與精密度進行研究。

2 結果與分析

2.1 顯色條件的選擇

2.1.1 最佳吸收波長的確定 吸收波長在比色定量方法中是最關鍵的。按試驗方法，在顯色溫度85 ℃，加熱時間20 min，硫酸加入量5.0 mL，0.1%咔唑無水乙醇溶液用量0.25 mL條件下，在360~700 nm波長內，對果膠水解產物半乳糖醛酸在硫酸溶液中與咔唑試劑發生縮合反應后，生成的紫紅色絡合物進行吸收波長掃描，結果見圖1。可以看出，50 mg·L-1和90 mg·L-1的半乳糖醛酸溶液表現出一致的規律，即與咔唑試劑發生縮合反應后，生成的紫紅色絡合物在394 nm附近和525 nm附近處各有1個吸收峰，在525 nm附近吸光度最大。因此本方法選擇λmax=525 nm作為合適的工作波長。

2.1.2 咔唑無水乙醇溶液用量的確定 咔唑無水乙醇溶液為顯色劑，其加入量嚴重影響顯色效果。按試驗方法，在顯色溫度85 ℃，加熱時間20 min，硫酸加入量5.0 mL條件下，改變0.1%咔唑-無水乙醇溶液用量，測其吸光度A，重復3次，結果見圖2。可以看出，無論是70 mg·L-1還是100 mg·L-1的半乳糖醛酸溶液，在咔唑-無水乙醇溶液用量為0.20~0.35 mL時吸光度較大，用量為0.25 mL時吸光度最大。故選擇咔唑-無水乙醇溶液最佳用量為0.25 mL。

2.1.3 硫酸用量的確定 半乳糖醛酸在硫酸中與咔唑試劑發生縮合反應，因此硫酸的加入量直接影響到縮合反應的快慢，嚴重影響顯色效果。在顯色溫度85 ℃，加熱時間20 min，0.1%咔唑無水乙醇溶液用量0.25 mL條件下，分別對加硫酸量為1.0~9.0 mL的半乳糖醛酸溶液進行顯色，重復3次，結果見圖3。可以看出，無論是70 mg·L-1還是100 mg·L-1的半乳糖醛酸溶液，硫酸加入量為4.0~6.0 mL時吸光度都較大，且5.0 mL時吸光度最大，故選擇5.0 mL為硫酸最佳加入量。

2.1.4 顯色溫度的確定 試驗在硫酸加入量5.0 mL，0.1%咔唑-無水乙醇溶液用量0.25 mL，加熱時間20 min條件下，分別對溫度為25~100 ℃時的半乳糖醛酸溶液進行顯色，重復3次，結果見圖4。可以看出，無論是70 mg·L-1還是100 mg·L-1的半乳糖醛酸溶液，溫度75~95 ℃間吸光度都較大，且85 ℃時最大，故選擇85 ℃為最佳顯色溫度。這對張小玲等[12]在室溫下進行顯色的傳統方式進行了改進。

2.1.5 顯色時加熱時間的確定 在硫酸加入量5.0 mL，0.1%咔唑-無水乙醇溶液用量0.25 mL，顯色溫度85 ℃條件下，設加熱時間0、5、10、15、20、25、30、40 min 8個處理，重復3次，顯色后測定其吸光度，結果見圖5。可以看出，70 mg·L-1和100 mg·L-1的半乳糖醛酸溶液表現出一致的規律，即不加熱的處理吸光度最低，加熱5 min起吸光度迅速升高，20 min達到最高，超過20 min后吸光度略有下降，可能是加熱時間過長時破壞了半乳糖醛酸的結果，故選擇20 min為最佳顯色時間。本方法與張小玲等[12]在室溫下進行顯色需要穩定1.5 h相比，大大縮短了顯色時間，提高了工作效率。

2.1.6 冷卻方式和顯色后穩定時間的確定 由于顯色條件是85 ℃水浴，如果采取室溫下自然冷卻，冷卻時間就會較長，冷卻過程中顯色溶液的穩定性就值得考慮。對不同濃度的半乳糖醛酸溶液顯色后在室溫條件下自然冷卻過程中525 nm波長處吸光度的變化進行了觀察，重復3次，試驗結果見圖6。可以看出，30 mg·L-1和50 mg·L-1的半乳糖醛酸溶液經過顯色后，在自然冷卻條件下，吸光度都隨冷卻時間的延長而逐漸降低。以冷卻15 min時為起點，在冷卻30 min時吸光度降低了1.5%~1.7%，在冷卻45 ~105 min時吸光度降低了2.6%~9.5%。因此在室溫自然冷卻條件下，半乳糖醛酸在硫酸中與咔唑試劑發生縮合反應后生成的紫紅色絡合物不穩定，無法確定最佳的測定時間，說明室溫自然冷卻條件不可行。

鑒于室溫自然冷卻條件不可行，進行了自來水浴快速冷卻試驗，即水浴加熱后立即將盛有顯色溶液的玻璃試管放入自來水中進行冷卻。本試驗對顯色后105 min內分別對70 mg·L-1和100 mg·L-1的半乳糖醛酸溶液在525 nm波長下的吸光度進行了測定，結果見圖7。可以看出，在自來水浴快速冷卻條件下，無論是低濃度還是高濃度的半乳糖醛酸溶液，顯色后105 min內顯色溶液吸光度相對穩定，低濃度溶液降低了0.9%，高濃度溶液降低了0.3%，都不超過1.0%。說明自來水浴快速冷卻方式可行，并在半乳糖醛酸溶液顯色后1.5 h內進行比色測定即可（但必須在水浴加熱后立即放入自來水中進行冷卻，否則吸光度將逐漸降低）。該方法延長了體系穩定時間，克服了文獻[4]中所用方法顯色后在自然冷卻條件下必須在20 min內測定的局限性。

2.2 樣品分析

2.2.1 線性范圍 水果及其制品中果膠含量較高的樣品，對處理后待測液必須稀釋到線性范圍內才能進行測定。在0~120 mg·L-1內，525 nm波長條件下，半乳糖醛酸與咔唑試劑發生縮合反應后生成的紫紅色絡合物吸收值與半乳糖醛酸濃度具有良好的線性關系（圖8），回歸方程為y=0.014 2x-0.007 5，R2=0.999 4，為穩妥起見，本方法將標準曲線的線性范圍定為0~100 mg·L-1。

2.2.2 準確度 以香蕉、獼猴桃和桃為試驗樣品，對方法的準確度進行了試驗，回收率試驗測定結果見表1。可以看出，以半乳糖醛酸為添加物質，不同添加水平下，香蕉、獼猴桃、桃3個樣品的添加回收率都較高，均能達到一般理化品質測定的要求，其中香蕉的回收率為86.7%~95.6%，獼猴桃的回收率為92.0%~98.6%，桃的回收率為87.6%~96.5%，測定結果符合測定方法標準的基本要求[13]，表明本方法準確度良好，符合測定要求。

2.2.3 精密度 由同一操作者用相同的前處理和設備，在短時間內對香蕉、獼猴桃、桃、甜櫻桃、橙汁、葡萄汁等不同樣品中的果膠含量進行了重復測定，檢測結果見表2。葡萄汁樣品變異系數最高（4.38%），其余樣品變異系數均低于4.0%，說明本方法精密度高，符合測定方法標準的基本要求[13]。

3 討 論

當果膠沉淀物從樣品提取液里被離心分離時，往往有一些不溶性固體微粒懸浮在上清液中，隨著上清液的棄去而流失，就有可能造成測定結果偏低或回收率低，為了避免這種現象，可在第1次提取時加入少量濾紙屑。同時，針對果膠含量較低的樣品如葡萄汁等，可通過適當增加稱樣量或減小定容體積的方式來提高測定的靈敏度和準確度。

試驗發現當濃硫酸中NO3-、Fe3+、Cu2+含量達到一定范圍時，對測定有干擾。C（Fe3+）＞0.000 1%或C（NO3-）＞0.000 1%時，加入咔唑-無水乙醇溶液后待測液出現深綠色，C（Cu2+）＞0.000 01%時，加入咔唑-無水乙醇溶液后待測液出現深藍色，這些顏色都會干擾或掩蓋半乳糖醛酸與咔唑試劑發生縮合反應生成的絡合物所呈現的紫紅色，此時應考慮硫酸的純度。本方法建議采用正規廠家生產的優級純硫酸，在測定前應做硫酸與咔唑溶液反應試驗，不產生顏色反應時方可使用。

試驗表明，加硫酸所用的時間很關鍵，如果在6 s內快速加入5.0 mL硫酸，溶液的溫度能達到約85 ℃，這就能使顯色溶液和水浴的溫度都保持在85 ℃左右，可以達到最佳的顯色效果。因此建議借助加液槍或瓶口分配器等來快速加入硫酸。

4 結 論

根據試驗結果，認為硫酸-咔唑比色法測定水果及其制品中果膠含量的最佳顯色條件為：在1.0 mL濾液中，加入0.25 mL 0.1%咔唑-無水乙醇溶液，迅速加入5.0 mL硫酸，于85 ℃水浴20 min后在自來水浴中冷卻，1.5 h內在525 nm波長條件下測定。該條件下標準曲線線性范圍廣、相關性好，精密度和準確度符合相關標準要求。

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