有氧運動和白藜蘆醇對肥胖大鼠脂聯素受體及下游信號通路的影響

摘要：為了探討有氧運動和白藜蘆醇對肥胖大鼠脂聯素受體及下游信號通路的影響及機制，將40只大鼠分成5組，分別為普通對照組（C）、肥胖模型對照組（D）、肥胖運動組（E）、白藜蘆醇對照組（F）、白藜蘆醇運動組（G）；造模完成后，E和G組采用6周跑臺訓練，F和G組按照大鼠稱重后40 mg/kg的白藜蘆醇（Res）劑量進行6周灌胃。用ELISA法測得血清脂聯素；RT-PCR方法測得AdipoR1、AdipoR2及PPARγ、AMPKα蛋白表達。結果發現：（1）血清脂聯素水平模型組低于普通對照組，而模型組中白藜蘆醇運動組最高；（2）脂聯素受體1和2的蛋白表達，白藜蘆醇運動組均高于其它各模型組；（3）普通對照組PPARγmRNA表達最高，而AMPKαmRNA表達白藜蘆醇運動組最高；以上結果說明，本實驗中通過運動和白藜蘆醇聯合干預，提高血清脂聯素及受體的水平，從而降低TG、GLU等相關指標，脂聯素受體激活下游信號通路蛋白AMPKαmRNA和PPARγmRNA，并使其表達增加，從而在一定程度上改善大鼠內臟脂肪細胞的紊亂，減少脂肪合成，增加血清TG清除，減少脂肪組織脂肪積聚，對改善大鼠肥胖起到了一定的作用。

關鍵詞：運動生物化學；脂朕素受體；有氧運動；白藜蘆醇；血清脂聯素；大鼠

中圖分類號：G804.7 文獻標識碼：A 文章編號：1006-7116（2012）06-0139-06

肥胖癥與高血壓、高血脂、高血糖等心腦血管疾病密切相關，研究肥胖的發生及控制的理論與方法是目前亟待解決的問題。發生肥胖的原因眾多，其中，高脂飲食和不正確的生活方式，是引起肥胖發生最主要的因素[1]。

脂聯素作為近年來發現的一種由脂肪細胞分泌的特異性蛋白，可通過與靶細胞膜上的脂聯素受體結合，激活下游信號通路，促進脂肪酸氧化和葡萄糖攝取，參與葡萄糖、脂肪代謝調節。近年來研究顯示，運動和白藜蘆醇單獨干預均可提高脂聯素及受體水平[2-3]，但通過雙重干預的作用，對脂聯素受體下游信號通路的研究尚未見到報道。本研究試圖通過二者聯合干預的共同作用，觀察脂聯素及受體下游信號通路蛋白表達的變化，探討有氧運動和白藜蘆醇聯合干預的疊加作用，為更有效改善肥胖癥提供實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物與動物分組

雄性SD大鼠40只（（190±5.0） g，購自廣州中醫藥大學），適應性喂養1周后（環境溫度20～25℃），隨機分為5組每組8只：普通對照組（C）、肥胖模型對照組（D）、肥胖運動組（E）、白藜蘆醇對照組（F）、白藜蘆醇運動組（G）。普通對照組采用普通飼料喂養，其它各模型組均為高脂飼料喂養，自由飲食飲水。高脂飼料比例（質量比）：碳水化合物（60%）、蛋白質（20%）、脂肪（5%）。高脂喂養26周。分組時組間體重無顯著性差異。

1.2 動物運動及灌胃方式

訓練模型：Bedford等根據大鼠體重/攝氧量回歸方程所建立的遞增運動負荷訓練大鼠模型[4]。正式訓練前，大鼠進行適應性訓練1周。正式訓練開始，速度為運動強度65% VO2max，20～25 m/min；每天訓練1 h，09：00～10：00訓練，每周訓練5 d。共6周。

給藥時間和劑量：模型建立成功后，F組和G組每天08：00給藥，每周7 d。大鼠稱重后按照40 mg/kg劑量的白藜蘆醇（Res）溶于1 mL的雙蒸水中，形成混溶液后進行灌胃[5]。

1.3 動物組織取材

訓練、灌藥結束后取材，各組大鼠采用水合氯醛麻醉，取腹部正中線切口，迅速腹主動脈取血6～8 mL，采血后，快速取出腹部脂肪組織稱量并記錄，做好標記，立即將脂肪標本置于液氮中，然后放于-80 ℃的冰箱中保存。

1.4 血液指標的測定

將3 mL血置于EDTA抗凝管中，以4 000 r/min離心5 min分離血清，取2 mL置于EDTA抗凝管中。血脂、血糖、HDL（好膽固醇）、LDL（壞膽固醇）檢測均采用暨南大學華僑醫院全自動生化分析儀（HITACH公司7020全自動生化分析儀）進行測定。

血清脂聯素的測定采用酶聯免疫吸附法，具體步驟按試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）說明進行。其原理為雙抗體夾心法，即用初抗包被，標準品或待測樣品中的脂聯素與其特異性結合，再加入標記的兔抗鼠脂聯素抗體，它可與SA-HRP特異性結合。SA-HRP可催化底物顯色，加入中止液，用酶標儀讀取每孔的光密度值，樣品中脂聯素的濃度與其光密度值成正比關系。

1.5 RT-PCR法測定大鼠脂肪組織基因表達

用RT-PCR方法測定脂肪組織中AdipoR1、AdipoR2、AMPK、PPARγ的mRNA基因表達。（引物序列見表1）。

用Trizol試劑，采用一步法提取組織中總RNA，逆轉錄（RT）（按試劑盒說明書），然后進入PCR反應，PCR過程：30 μL PCR反應體系：15×PCR buffer 2 μL，dNTP 0.5 μL、Taq酶0.4 μL、MgCl2 22 μL、ddH 2O 7.3 μL、引物各2 μL。PCR循環反應條件：AdipoR1和R2 94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；AMPKα、PPARγ 97 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共50循環。結果用SMART VIEW ANALYSIS PROGRAM凝膠成像分析軟件系統進行處理分析。

1.6 數據處理

所有數據以平均數±標準差（ ±s）表示，使用SPSS17.0軟件包進行統計學處理，選用單因素方差分析，P<0.05表示差異有顯著性，P<0.01表示差異有非常顯著性，同時采用Excel2007進行圖形處理。

2 實驗結果及分析

2.1 高脂模型的指標體系

大鼠跑臺訓練結束后，在最后一次訓練結束后5 h內測定大鼠血清甘油三酯（TG）、血糖（GLU）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）。結果見表2。

從表1可以看到，D組的TG、GLU、LDL值都顯著高于其他各組（P<0.01），G組TG低于其它各模型組，G組HDL高于其它各模型組，F組高于E組但無差異性，G組LDL低于D組且差異存在非常顯著性（P<0.01）。

2.2 六周訓練期間大鼠體重變化

從圖1中可見，肥胖大鼠模型建立成功后，進行6周訓練和白藜蘆醇干預，D組大鼠體重一直處于增長的態勢且高于其它各組，差異具有非常顯著性（P<0.01）；E組和G組開始運動的1周體重出現了下降的拐點，到第2周恢復上升趨勢，直到6周末增長速度都較為緩慢，其中G組更為緩慢。

從圖2A中看到，C組血清脂聯素質量濃度最高，F組低于E組，D組顯著低于其它各組（P<0.01）；圖2 B中C組的AdipoR1mRNA表達低于G組，差異存在顯著性（P<0.05），AdipoR2mRNA表達C組最高，D組AdipoR1mRNA和AdipoR2mRNA表達低于C組，差異存在非常顯著性（P<0.01）。G組AdipoR1mRNA和AdipoR2mRNA表達均高于其它各模型組。

2.4 各組大鼠脂肪組織PPARγmRNA表達的變化

圖3中顯示，D組PPARγmRNA低于其它各組，且差異有非常顯著性（P<0.01），模型組均低于普通安靜組，差異存在顯著性（P<0.05），G組高于其它模型組，但差異無顯著性。

2.5 各組大鼠脂肪組織AMPKαmRNA表達

從圖4中可以看出：D組低于其它各組且差異存在非常顯著性（P<0.01），G組高于其它各模型組，且差異存在非常顯著性（P<0.01）。

目前在研究肥胖的發病機制及治療方案中，建立可靠的動物模型是非常關鍵的。鑒于高脂飲食是誘導肥胖發生最主要的因素，同時高脂飲食作為營養性肥胖造模最常用的方法，本實驗通過20周的高脂飲食喂養，成功建立了營養性肥胖大鼠模型。為下一步實驗工作提供了研究基礎和平臺。肥胖模型建立成功后，經過6周的跑臺訓練和白藜蘆醇聯合干預后，白藜蘆醇運動組大鼠的TG、GLU、LDL明顯降低，HDL增加，體重增加較肥胖模型組緩慢，表明有氧運動及白藜蘆醇聯合干預對減輕肥胖有一定效果，也印證了適宜運動和白藜蘆醇可以改善肥胖的癥狀。

3.2 運動和白藜蘆醇對脂聯素及其受體的影響

脂聯素是脂肪組織特異性分泌的一種脂肪細胞因子，它能夠影響機體處理糖類和脂肪的能力。脂聯素除了直接作用于外周組織，也通過作用于中樞神經系統來提高糖脂代謝，從而減輕體重，減少脂肪含量。脂聯素作用的機制與其兩個受體有關，即AdipoR1、AdipoR2[6]。脂聯素受體在脂肪代謝、分化過程中具有重要作用。

本實驗結果發現，肥胖模型組血清脂聯素及其受體明顯低于普通對照組，表明肥胖大鼠脂聯素水平降低；脂聯素水平與脂肪量成反比，脂聯素降低是體脂增加的一個反饋抑制，這可能是肥胖進一步發展的因素之一。大量的研究表明通過運動可以提高脂聯素及其受體水平[7-9]，本研究結果與前人研究一致，肥胖運動組血清脂聯素及其受體表達提高，說明通過運動干預可上調脂聯素水平，從而降低體脂，加速脂代謝水平，一定程度上改善機體肥胖。

白藜蘆醇主要來源于葡萄、虎杖等植物，具有降血脂[10]、抗氧化[11]等作用。白藜蘆醇可調節載脂蛋白，作為配體與相應受體結合，參與脂蛋白的代謝，促使體內脂代謝趨于正常，從而調節機體脂質與脂蛋白代謝紊亂，Leonor River a 等人檢測到經白藜蘆醇預處理后，肥胖Zuker大鼠內臟脂肪組織脂聯素的含量明顯增加，提示白藜蘆醇對脂聯素合成具有上調的作用[12]。本實驗中單純白藜蘆醇干預組，脂聯素水平及其受體表達均高于肥胖模型組，這可能是因為白藜蘆醇激活了Sirt1，限制了機體攝入過多熱量；Sirt1能通過激活轉錄因子（Foxo1）并調節轉錄因子（Foxo1）與C/EBP的相互作用，增加血清脂聯素及其受體的表達。

研究發現通過有氧運動和白藜蘆醇單獨干預，均可提高肥胖大鼠脂聯素及其受體的表達；本研究的重點在于觀察二者的共同干預作用，結果發現白藜蘆醇運動組脂聯素及受體表達高于有氧運動組或白藜蘆醇單獨干預組，提示二者共同干預對脂聯素及受體的表達具有疊加效應，這可能是在雙重刺激下，脂聯素受體下游信號通路蛋白增加，結合脂聯素基因啟動子上PPRE，增強脂聯素基因啟動子的活性，影響脂聯素的表達和分泌。

3.3 運動和白藜蘆醇對脂聯素下游信號通路的影響

脂聯素在靶細胞膜上與脂聯素受體結合，可激活下游信號通路蛋白AMPK、PPAR等，從而參與對葡萄糖、脂肪代謝過程的調節。脂聯素通過與受體結合刺激PPAR，使其活性提高，從而增加葡萄糖的攝取和脂肪酸氧化[13]。Tsuchida等[14]用脂聯素作用C2C12細胞后發現PPAR配體活性提高，刺激了脂肪酸氧化，說明PPAR可能是脂聯素傳導信號通路中的一個重要信號分子。最新研究顯示8周的運動訓練能夠上調骨骼肌中PPARγ表達，從而提高抗炎作用，有效抑制膽固醇的運輸[15]。Yamauchi等[6]用脂聯素作用C2C12肌細胞后，發現AMPK及Acc的磷酸化增加，當C2C12肌細胞AdipoR1表達提高后，上述效應更為明顯，說明脂聯素通過與受體結合，活化AMPK進而發揮生物學作用。長期運動可對AMPK活性反復刺激，在運動適應過程中提高骨骼肌安靜狀態AMPK的活性[16-18]。

本實驗中通過6周運動發現，肥胖運動組較肥胖模型對照組PPARγ和AMPKα蛋白表達升高。有氧運動時機體動員脂肪供能占優勢，釋放FFA進入血液，氧化供能。另外，也動員和氧化脂肪組織內甘油三酯，使血液和細胞內FFA處于活躍的產生、利用的動態過程之中。許多脂肪酸是PPARγ的天然配體，因此推斷運動通過對內源性配體的影響，激活PPARγ表達。同時運動上調脂聯素受體與PPARγ和AMPKα結合刺激脂肪酸氧化，增加血清TG清除，減少脂肪組織脂肪積聚。

研究發現白藜蘆醇是PPARγ的激活劑[19]。小鼠實驗證明，白藜蘆醇能夠改善高脂飲食誘導的肥胖、胰島素抵抗[20]。李曉寒等研究發現高脂條件下，白藜蘆醇能激活PPARγmRNA的表達從而抑制脂代謝紊亂。Jing Shang等發現白藜蘆醇能促進AMPK磷酸化，從而表現出改善胰島素抵抗的作用[21]。通過白藜蘆醇改善高脂誘導的IR大鼠的研究，發現此過程與激活AMPK有關[22]。本研究中白藜蘆醇組較肥胖模型對照組 PPARγ和AMPKα蛋白表達升高，這與脂聯素及其受體升高進而激活下游通路AMPKα蛋白的表達有關，其機制可能是白藜蘆醇通過激活SIRT1和PGC-1途徑完成。白蘆藜醇激活下游信號通路蛋白，在一定程度上提高糖代謝的水平同時減少脂質沉積。

本研究首次探討運動訓練和白藜蘆醇共同干預對脂聯素受體下游信號通路蛋白表達的影響。研究發現，6周跑臺訓練或白藜蘆醇單獨干預均能提高脂聯素受體下游通路蛋白的表達，這對于改善大鼠肥胖具有重要意義。那么二者共同干預能否起到疊加效應呢？結果顯示二者共同干預能夠提高肥胖大鼠脂肪組織中脂聯素受體下游蛋白表達，其中PPARγ蛋白表達量高于其它各模型組，但無顯著性差異；而AMPKα蛋白表達顯著高于其它各模型組。二者呈現出疊加效應。二者共同干預增加了PPARγ和AMPKα蛋白的表達，表明運動訓練和白藜蘆醇共同干預比單一因素干預，更有有效的激活了肥胖大鼠脂聯素受體下游信號通路，使通路蛋白表達增加。

本研究通過運動和白藜蘆醇聯合干預動物試驗，使脂聯素及其受體水平升高，同時增加了下游信號通路中PPARγ和AMPKα蛋白表達。脂聯素受體和下游蛋白相結合刺激脂肪酸氧化，在一定程度上改善大鼠內臟脂肪細胞的紊亂，減少脂肪合成，增加血清TG清除，減少脂肪組織脂肪積聚。因此，本研究認為有氧運動和白藜蘆醇聯合干預可能是一種改善肥胖癥的理想方法。

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