皮膚鱗狀細胞癌及Bowen病中PGP9.5和CyclinD1的表達及臨床意義

[摘要]目的：探討 PGP9.5和CyclinD1在皮膚鱗狀細胞癌(CSCC)、Bowen病中的表達及臨床意義。方法：用免疫組織化學SP法檢測22例CSCC，31例Bowen病及10例正常皮膚組織中PGP9.5和CyclinD1的表達情況。結果：PGP9.5與CyclinD1在CSCC的表達明顯高于正常皮膚組（P=0.006，P=0.00057，<0.05）和Bowen病組（P<0.05），PGP9.5與CyclinD1在低分化鱗癌的表達明顯強于高分化鱗癌的表達（P<0.05）。在CSCC、Bowen病中，PGP9.5與CyclinD1的陽性表達存在相關性。結論：PGP9.5、CyclinD1的高表達和鱗癌細胞分化程度有密切關系。

[關鍵詞]皮膚鱗狀細胞癌(CSCC)；Bowen病；PGP9.5；CyclinD1；免疫組織化學

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）03-0424-03

Expression and Significance of PGP9.5 and CyclinD1 in Human Skin Squamous Cell Carcinoma and Bowen's Disease

NIE Jian-jun1，2，ZENG wei-hui1，GENG song-mei1，XU-lei2

(1.Department of Dermatology，The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710004，Shaanxi，China; 2.Department of Dermatology of The Second Hospital of Chengdu )

Abstract: Objective To study the expression of PGP9.5and CyclinD1 in Cutaneous squamous cell carcinoma and Bowen's disease and exploring the relationship between them and to confirm their role in development of the tumor. Methods Immunohistochemical S-P method was used to examine the expressions of PGP9.5 and CyclinD1 in 22 cases of CSCC， 31cases of Bowen's disease， and 10 cases of normal skin. Results The expression of PGP9.5 and CyclinD1 was significantly higher in CSCC than in normal tissue and Bowen's disease （P=0.006，P=0.00057<0.05）. The expression of PGP9.5 and CyclinD1 was significantly stronger in poorly differentiated CSCC than in well differentiated CSCC（P<0.05）. The positive expression of PGP9.5 and CyclinD1 are positive correlations in CSCC and Bowen's disease. Conclusion The co-expression of PGP9.5 and CyclinD1 is related with carcinogenesis and m alignant progression of CSCC and Bowen's disease.

Key words:Cutaneous Squamous cell carcinoma(CSCC); Bowen's disease;PGP9.5;CyclinD1; immunohistochemistry

蛋白基因產物9.5(protein gene product，PGP9.5)屬于泛素水解酶家族，廣泛分布于神經元分化的各個階段，為神經內分泌腫瘤的標志物[1-2]。近年發現PGP9.5在肺、食管及間充質等的腫瘤有高表達[3-6]。PGP9.5通過泛素-蛋白酶體途徑降解細胞核內蛋白及細胞周期調節蛋白。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）屬于細胞周期調節因子，在腫瘤的發生中起很重要的作用。有關PGP9.5介導的泛素-蛋白酶體途徑在CyclinD1參與的調節細胞周期蛋白的機制中發揮的作用，及PGP9.5和CyclinD1在腫瘤的發生發展所扮演的角色受到了學者們的關注。筆者應用免疫組化SP法檢測皮膚鱗狀細胞癌、Bowen病及正常皮膚組織中PGP9.5及CyclinD1的表達情況，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料收集：2006年1月至2010年3月西安交通大學醫學院第二附屬醫院皮膚科皮膚鱗狀細胞癌蠟塊22例，其中男10例，女12例，年齡56～83歲Bowen病31例，男14例，女17例，年齡58～82歲。另選用美容手術切除的正常皮膚組織10例做對照，其中男4例，女6例，年齡20～65歲。

試劑：①兔抗人PGP9.5多克隆抗體 編號：（ZA-0263）；②兔抗人CyclinD1單克隆抗體編號：（ZA-0101）；③SP通用試劑盒9000，均購自北京中杉生物科技有限公司。

1.2 方法：10%福爾馬林緩沖液浸泡24h后石蠟包埋。4μm連續切片，蘇木精-伊紅染色5張，采用SP法免疫組化染色， 按說明書操作。每批染色用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。每例取一張切片按常規行HE染色，光鏡下進行病理分級，并與免疫組化結果對照觀察。

1.3 結果判斷：PGP9.5陽性染色主要表達細胞胞漿的棕黃色或褐色顆粒，CyclinD1以細胞核染色為棕黃色顆粒為陽性。同一標本高倍鏡下（10×40）隨機各取5個視野鱗癌組織計數其細胞總數及陽性細胞數。按陽性細胞所占的百分比計分：取5個高倍鏡觀察陽性細胞的平均值。陽性細胞表達強弱等級按PGP 9.5 / CyclinD1陽性表達占腫瘤細胞百分比表示0級（<0.5%），+（1%～10%），++（10%～20%），+++（>20%）。

1.4 統計學方法：本實驗采用半定量等級資料，觀察陽性細胞數，得出表達陽性級別，然后進行等級資料統計，采用非參數等級資料的秩和檢驗。應用SPSS13.0統計軟件，對于計數資料采用確切概率法進行檢驗，并計算Pearson列聯系數判定關聯程度。P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 PGP9.5 和CyclinD1在正常皮膚、Bowen病和CSCC中的表達（表1）：PGP9.5在正常皮膚上皮細胞表達基本呈陰性，黑色素細胞陽性。汗腺、毛囊旁神經纖維組織黃褐色染色。在10例正常組織標本中有1例上皮細胞染色弱陽性（陽性率10%）。在31例Bowen病例標本中，異型的角質形成細胞胞漿染色陽性，呈黃褐色（圖1），有11例染色陽性（陽性率35.5%）。在22例CSCC標本中，有14例呈陽性染色，腫瘤細胞胞漿染色黃褐色、棕褐色（圖2、3）（陽性率63.6%）。正常皮膚與Bowen病的表達差異比較，χ2=2.37，P>0.05。PGP9.5在二者之間表達無顯著差異。PGP9.5在正常皮膚、CSCC的陽性表達差異比較P=0.006<0.05，有顯著的統計學意義。Bowen病與CSCC的PGP9.5表達差異比較，χ2=4.09，P<0.05，二者表達有顯著統計學差異。PGP9.5在CSCC的表達明顯高于Bowen病組織。

CyclinD1在正常皮膚組織的細胞核表達呈陰性，在10例正常皮膚標本中，有1例弱陽性（陽性率10%）。在Bowen病中，CyclinD1在異型的角質形成細胞細胞核染色陽性，呈黃褐色（圖4）。在31例Bowen病例標本中，有15例染色陽性，（陽性率48.4%）。在CSCC中，CyclinD1在鱗癌細胞的細胞核表達呈棕褐色（圖5、6）。在22例CSCC例標本中，有17例呈陽性染色（陽性率77.3%）。CyclinD1在正常皮膚與Bowen病陽性表達比較χ2=4.82，P<0.05。CyclinD1在正常皮膚、CSCC的陽性表達比較P=0.00057<0.01.差異有統計學意義。CyclinD1在CSCC的表達明顯高于正常組織。Bowen病與CSCC的表達比較，χ2=4.48，P<0.05，二者表達有顯著差異。CyclinD1在CSCC的表達明顯高于Bowen病。

2.2 PGP9.5和CyclinD1在CSCC不同病理分級中的表達（表2）：PGP9.5在CSCC不同病理分級中的鱗癌細胞染色的比率及染色強度不同，在12例高分化鱗癌（Ⅰ、Ⅱ級）中，有6例表達陰性，強陽性（++、+++）3例，低分化鱗癌（Ⅲ、Ⅳ級）中有2例表達陰性，強陽性7例，根據兩組等級資料的秩和檢驗P<0.05。PGP9.5在CSCC不同分級的表達有顯著差別。低分化鱗癌PGP9.5的表達比高分化鱗癌的表達強。

CyclinD1在CSCC不同病理分級中的鱗癌細胞染色的比率及染色強度不同，在12例高分化鱗癌中，有4例表達陰性，強陽性4例，低分化鱗癌中有1例表達陰性，強陽性7例，根據兩組等級資料的秩和檢驗P<0.05。CyclinD1在CSCC不同病理分級中陽性表達有顯著差別。低分化鱗癌CyclinD1的表達比高分化鱗癌的表達強。

2.3 PGP9.5和CyclinD1分別在Bowen病組織和CSCC組織陽性表達的關聯性分析顯示：Bowen病組（P<0.05，r=0.53）。CSCC組（P<0.05，r=0.44）表明PGP9.5和CyclinD1在Bowen病組織和CSCC組織陽性表達均有相關性。

3 討論

3.1 PGP9.5又名泛素羧基末端水解酶1(ubiquitin-C- terminal hydrolase L1，UCHL-1)是神經元特異性羧基末端水解酶，PGP9.5是蛋白降解途徑中的關鍵酶，在細胞水解途徑中調節細胞的分裂周期和死亡。研究發現PGP9.5存在于多種腫瘤組織中，其過度表達和腫瘤的發展有正相關關系。但其在皮膚腫瘤中的研究尚未見報道。我們的研究發現，PGP9.5在CSCC的表達明顯高于正常皮膚組織和Bowen病組織（P<0.05），提示PGP9.5在CSCC的發生及由Bowen病向CSCC發展過程中可能起著一定的作用。而PGP9.5在低分化鱗癌的表達強度比高分化鱗癌明顯增加（P<0.05），即在惡性程度較高的CSCC中，PGP9.5的表達較高，提示PGP9.5在皮膚角質形成細胞的致瘤性轉化中也可能起一定的作用。在對食管鱗癌的研究[2]發現過表達PGP9.5的鱗癌細胞對紫外線的敏感性增加，推測高表達的PGP9.5和紫外線的長期照射可能在CSCC的發生和發展的過程中起協同作用。至于高表達PGP9.5的Bowen病是否更易發展為CSCC，需進一步研究。Bheda等[7]實驗研究發現PGP9.5與β-Catenin/TCF信號之間有正相關調節作用。因此PGP9.5也可能通過該信號依賴的轉錄誘導c-myc，cyclin D，c-jun，survivin等原癌基因蛋白的表達，導致CSCC的發生。

3.2 CyclinD1作為細胞周期中重要的調控因子，其基因多態性的不同對腫瘤的形成有不同的影響[8-9]。本實驗對Bowen病、CSCC中CyclinD1的研究發現，CyclinD1在CSCC、Bowen病和正常皮膚之間的表達有顯著差異（P<0.05）。低分化CSCC的表達比高分化CSCC強，提示CyclinD1與腫瘤的發生，發展及惡性程度有關。這與其他腫瘤的研究結果一致[10-11]，應用CyclinD1的抑制劑或轉導入反義CyclinD1抑制其表達，可以使鱗癌停止生長，腫瘤面積縮小和逐漸好轉[12]。

3.3 本研究PGP9.5與CyclinD1在Bowen病組織和皮膚鱗狀細胞癌組織陽性表達的關聯性分析結果顯示，前者r=0.53，后者為r=0.44。表明PGP9.5與CyclinD1在Bowen病組織和皮膚鱗狀細胞癌組織陽性表達有相關性。說明二者的相互作用在CSCC的發生發展過程中起一定作用。有作者[13]通過UVB誘導鼠皮膚鱗狀細胞癌的形成，證實CyclinD1在鱗癌組織中過表達，通過增加CyclinD1的泛素化，泛素-蛋白酶途徑增加CyclinD1的降解，可以減少鱗癌的發生。Anjali等[14]研究結果也支持PGP9.5通過抑制細胞凋亡，和增加細胞增殖、遷移促進腫瘤的發生發展的假設。最近的研究發現[15]，一種E3重要的連接酶: 包括FBX4盒蛋白質晶體和aβ晶狀體蛋白的SCF復合體，其主要底物就是CyclinD1，而高表達的PGP9.5可能通過對CyclinD1的去泛素化，減少CyclinD1通過泛素-蛋白體通路的降解，使CyclinD1在細胞周期過表達，從而引起細胞的異常增殖，導致腫瘤的發生。

3.4 通過對PGP9.5與CyclinD1的初步研究，提示二者在皮膚的角質形成細胞致瘤性轉化過程中可能起到一定的作用，而且PGP9.5的表達與腫瘤的病理分期密切相關，為腫瘤發生發展的分子機制提供新的研究方向。但由于PGP9.5對許多細胞因子的調節作用以及其在泛素-蛋白酶體途徑中的水解酶活性和連接酶活性作用，其過表達在CSCC腫瘤生長途徑以及對其他實體鱗狀細胞癌的病理學機制上的研究，還須通過其對去泛素化下游區靶目標作用的進一步研究。

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[收稿日期]2011-10-25 [修回日期]2012-01-18

編輯/張惠娟