EGFP和CM-Dil示蹤骨髓間充質干細胞構建組織工程骨的體內研究

[摘要]目的：應用增強型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）和CM-Dil標記技術，觀察組織工程骨在體內形成過程中種子細胞的變化和轉歸。方法：分別用EGFP慢病毒表達和CM-Dil染料的方法標記比格犬骨髓間充質干細胞（Bone mesenchymal stem cells， BMSCs），MTT法檢測標記細胞的體外增殖能力。BMSCs接種珊瑚支架體外成骨誘導7天后，將未標記組、EGFP組和CM-Dil組分別植入裸鼠背部皮下，空白支架作為陰性對照。術后4、8、12周取材，HE染色觀察成骨情況，EGFP組采用GFP免疫組化、CM-Dil組冰凍切片熒光顯微鏡下示蹤BMSCs在體內的變化。結果：兩種標記技術能高效標記BMSCs，標記前后細胞的體外增殖無顯著性差異（P>0.05）。細胞-支架復合物植入體內12周后有新生骨形成，標記細胞數量隨時間延長而逐漸減少，12周后仍顯示有部分標記細胞存活。結論：EGFP和CM-Dil可用于示蹤組織工程種子細胞，通過示蹤說明BMSCs在體內組織工程骨成骨過程中發揮了重要作用。

[關鍵詞]EGFP；CM-Dil；骨髓間充質干細胞；示蹤；組織工程骨

[中圖分類號]Q813.1 R318 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）03-0406-04

The in vivo study of tissue engineered bone constructed with EGFP and CM-Dil labeled BMSCs

WU Jing-guo，XIE Fang-nan，MA Hui-yu，WANG Qian，CAO Yi-lin，XIAO Ran

(Research Center of Plastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College，Beijing 100144，China)

Abstract: Objective To observe the effect of BMSCs in fabricating tissue engineering bone in vivo using EGFP and CM-Dil labeling technology. Methods BMSCs isolated from Beagle Dogs were labeled using EGFP and CM-Dil separately and the proliferation abilities were analyzed by MTT assay. BMSCs were seeded onto the coral scaffolds and cultured in the osteogenic medium for 7 days.Then the BMSCs/Coral constructs were implanted into the nude mices subcutaneously.The constructs were divided into three groups:Unlabeled group，EGFP group，CM-Dil group.The specimens were collected respectively at 4，8 and 12 weeks after implantation and tissue engineered bone was evaluated by HE staining.The seeded BMSCs were traced by immunohistochemistry staining of GFP in the EGFP group and directly observed in the frozen section under the fluorescence microscope in the CM-Dil. Results BMSCs were labeled efficiently by both GFP and CM-Dil labeling technology and there was no statistical significance in BMSCs proliferation after labeling (P>0.05).The histological observation of three groups showed that there were engineered bone formed around the pores of the scaffolds after 12 weeks implantation. The labeled BMSCs were decreased gradually and could be detected up to 12 weeks in vivo. Conclusion EGFP and CM-Dil can be used to label and trace the seeded BMSCs in tissue engineered bone formation in vivo.

Key words: EGFP; CM-Dil; BMSCs; lable; tissue engineering bone

BMSCs是一類存在于骨髓中除造血干細胞以外的成體干細胞，其自我更新能力及多向分化潛能已被廣泛認識，是組織工程研究領域種子細胞的理想來源[1-3]。在骨組織工程研究中，BMSCs復合生物材料植入體內不但能夠生成新生的骨質，而且還可能具有分泌細胞因子、趨化機體自身細胞、促進局部微血管化等功能[4-5]，要深入研究BMSCs在組織工程骨形成過程中的作用，需要應用有效而不影響其功能的標記方法。

本實驗分別用EGFP和CM-Dil標記的BMSCs復合珊瑚支架植入裸鼠體內，示蹤BMSCs的存活情況，以及細胞標記后復合物的成骨能力。進一步明確BMSCs在裸鼠體內的異位成骨作用，并為組織工程種子細胞提供簡便直觀的標記方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：比格犬，雄性，12月齡，體重13kg，由北京瑪斯生物技術有限公司提供；裸鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器：Ficoll分離液（GE，瑞士）；DMEM、Hank's液、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶、雙抗（GIBCO，美國）；地塞米松、β-磷酸甘油鈉、維生素C、茜素紅、油紅O、MTT（Sigma，美國）；Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國）；EGFP病毒提取液（本實驗室王黔老師提供）；CM-Dil（Molecular Probes，美國）；堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成，南京），Ⅱ型膠原、GFP免疫組織化學一抗和二抗（中杉金橋，北京）；多聚甲醛、戊二醛（益利精細化學品，北京）；Quanta 200 環境掃描電子顯微鏡（FEI，捷克）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 BMSCs的分離培養及鑒定

1.3.1 BMSCs的分離培養：比格犬以0.12ml/kg的劑量肌注氯胺酮/速眠新（兩者2:1混合）麻醉，常規備皮、消毒、鋪巾，用骨穿針于髂后上嵴穿入骨髓腔，然后用含有1ml肝素（50U/ml）的20ml的注射器負壓抽取骨髓液4ml，加入4ml Hank's液混勻，小心加入含有4ml Ficoll淋巴細胞分離液的15ml離心管中，2 000r/min離心20min，吸取中間白色云霧狀的有核細胞層，DMEM洗滌2次，離心后細胞計數，將細胞懸液按1.0×106/ml的密度接種直徑為10cm的培養皿，置于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱內培養，48h后換液，清除未貼壁的細胞，7天后細胞克隆達80%融合，胰酶消化，按5.0×104/ml的密度傳代。選取第二代細胞備用。

1.3.2 三系誘導分化及鑒定：①成骨誘導：成骨誘導培養基（10-8 M地塞米松、0.01 M β-磷酸甘油鈉、0.05g/L維生素C、10%胎牛血清、1 雙抗）培養BMSCs 21天，4%多聚甲醛固定，堿性磷酸酶染色試劑盒染色；體積分數為95%的乙醇固定1h，2%茜素紅染色；4% 多聚甲醛固定，加入抗骨橋蛋白一抗和二抗，免疫熒光檢測；②成軟骨誘導：成軟骨誘導培養基（10ng/ml TGF-β1、40ng/ 地塞米松、50ng/ml維生素C、10%胎牛血清、1% 雙抗）誘導培養14天，4% 多聚甲醛固定，甲苯胺藍、番紅O染色；4%多聚甲醛固定，加入抗Ⅱ型膠原一抗和二抗，免疫細胞化學檢測；③成脂誘導：成脂誘導培養基（0.5mM IBMX、10-5 M胰島素、0.2mM吲哚美辛、10-6 M地塞米松、10%胎牛血清、1%雙抗）誘導培養14天，4%多聚甲醛固定，60%異丙醇處理，油紅O染色。

1.4 EGFP和CM-Dil標記BMSCs

1.4.1 EGFP標記BMSCs：成骨誘導后的BMSCs傳至P2代，達到80% 細胞融合后去除原成骨誘導培養基，加入無胎牛血清的DMEM 5 ml，然后在其中加入制備好的病毒液600μl，并加入Lipofectamine 2000以增強感染效率。24h后，棄掉含病毒的培養基，改用成骨誘導培養基繼續培養，熒光顯微鏡下觀察轉染效率，MTT法檢測細胞的增增殖能力。

1.4.2 CM-Dil標記BMSCs：收集P2代BMSCs制成密度為1.0×107/ ml細胞懸液（PBS懸浮），每1ml細胞懸液中加入40μl CM-Dil（1g/L），此時CM-Dil的終濃度為40μM。細胞懸液置于37℃，3min，然后冰浴15min，洗滌后按5.0×104/ml的密度接種到培養皿中。24h后，熒光顯微鏡下觀察標記后的細胞，MTT法檢測細胞的增殖能力。

1.5 BMSCs接種珊瑚支架植入裸鼠體內及檢測

1.5.1 珊瑚支架制備：選取西沙群島產致密橙黃濱珊瑚，加工成體積為5mm×5mm×1mm大小。用5%次氯酸鈉溶液浸泡2周，3天換液一次，然后用三蒸水沖洗，煮沸10min×3次，超聲清洗（5次，每次10min）后80℃烘干24h，高溫高壓滅菌后備用。

1.5.2 接種細胞：分別收集EGFP和CM-Dil標記后的BMSCs，以2.0×107/ml的密度接種珊瑚支架，成骨誘導培養基體外培養3h、3天、7天，2.5% 戊二醛固定，酒精脫水干燥，掃描電鏡觀察材料的孔隙率和接種后細胞-材料的粘附情況。

1.5.3 細胞-支架復合物植入裸鼠背部皮下：裸鼠12只，分3組。各組裸鼠右側背部皮下均植入空白珊瑚支架（每只3塊），左側分別植入體外成骨誘導培養7天的未標記、EGFP標記、CM-Dil標記的細胞-支架復合物。

1.5.4 取材：三組分別于術后4周、8周、12周取材，30% 甲酸脫鈣，石蠟包埋切片，HE染色，觀察其成骨情況；EGFP標記組通過GFP免疫組織化學示蹤植入BMSCs；CM-Dil標記組冰凍切片DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察植入BMSCs的變化。

1.6 統計學分析：采用SPSS16.0統計軟件包進行分析。MTT法各檢測時間點每組讀取4孔OD值，數據以x±s表示，組間比較采用配對t檢驗，P<0.05認為有統計學差異。

2 結果

2.1 BMSCs多向分化鑒定及EGFP、CM-Dil標記

2.1.1 分化鑒定：BMSCs原代培養7天，貼壁細胞形態呈長梭形，增殖迅速并生成大量克隆。成骨誘導21天后，堿性磷酸酶染色陽性（圖1A），茜素紅染色可見成骨分化后鈣質沉積（圖1B）；成軟骨誘導14天后，番紅O染色陽性（圖1C），Ⅱ 型膠原免疫細胞化學可見細胞分泌??型膠原（圖1D）；成脂誘導14天后，鏡下可見細胞質中大量脂滴出現（圖1E），油紅O染色陽性（圖1F）。

2.1.2 標記：EGFP、CM-Dil標記BMSCs 24h后，熒光顯微鏡下計數發現80% 以上的細胞激發出綠色熒光、紅色熒光（圖2）。MTT法檢測結果顯示7天細胞增殖進入平臺期，EGFP組、CM-Dil組與未標記組的生長曲線基本一致，各個時間點比較無統計學差異（P>0.05），表明標記對細胞增殖活性無明顯影響。

2.2 體外培養BMSCs-支架復合物：電鏡掃描細胞-支架復合物發現，接種3天后細胞已分泌大量基質，逐漸充滿整個孔隙。復合物體外培養7天置于熒光倒置顯微鏡下直接觀察，也看到激發出熒光的細胞在支架上黏附生長（圖3）。

2.3 體內植入復合物的組織學觀察：各組復合物植入體內4周，材料邊緣（珊瑚支架脫鈣處理）均出現少量新生骨基質（紅染區域），骨基質包圍大量新生的類骨質，形態似纖維組織，而空白材料植入后發現纖維組織長入，無骨基質形成；植入8周，隨著類骨質的成熟，骨基質的范圍逐漸擴大；植入12周，大部分區域成熟骨質已經形成，骨陷窩及其中的骨細胞清晰可見（圖4），而空白材料珊瑚支架在體內逐漸降解，被大量纖維組織替代。

2.4 EGFP、CM-Dil標記BMSCs體內示蹤觀察：EGFP免疫組織化學發現，4周大量表達GFP的細胞存在于植入的細胞-支架復合物中，8周逐漸減少，到12周僅能在組織邊緣看到少量GFP陽性細胞（圖5A）。CM-Dil標記組冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察顯示植入4周，標記后的BMSCs發出紅色熒光，熒光出現在材料邊緣區域，植入8周，紅色熒光仍然存在，熒光范圍比4周明顯減少，植入12周，紅色熒光進一步減少，只存在于少量細胞集落的邊緣區域（圖5B）。

3 討論

BMSCs來源廣泛，取材方便，具有向成骨細胞、軟骨細胞、肌腱、韌帶、神經細胞、脂肪細胞及骨髓基質等組織細胞分化的潛能，已被廣泛應用于細胞和組織工程、干細胞治療等領域[6-7]。對細胞進行標記示蹤是相關研究中必不可少的環節，在骨組織工程研究中，由于骨組織鈣鹽沉積的特點，給種子細胞的標記示蹤檢測帶來了困難，難以進行長期示蹤，從而需要探索有效的骨組織工程種子細胞的標記方法。

本實驗在裸鼠體內成功建立了異位成骨動物模型。支架材料應用天然濱珊瑚，孔隙率60% 左右，孔徑140～260μm，符合骨組織工程生物材料的要求[8-10]。分離培養比格犬BMSCs，復合支架體外成骨誘導，電鏡掃描顯示BMSCs分泌細胞外基質充滿材料孔隙，說明細胞-材料相容性良好。空白珊瑚支架植入裸鼠皮下發現3個月完全降解，和文獻報道相一致[11]，而細胞-支架復合物由于細胞分泌大量基質，延緩了材料降解速率，從而有利于BMSCs以材料的三維結構為支撐形成組織工程骨，12周組織學發現形成了大量成熟骨基質。

GFP已廣泛用于蛋白質、細胞器的標記及基因表達的研究[12-14]，其突變體EGFP的熒光強度是野生型的35倍。CM-Dil是親脂性熒光染料，嵌入細胞膜從而標記整個細胞[15]，近年來逐漸用于細胞移植的示蹤研究，具有使用簡便、染色快速、熒光衰減慢、標記效率高等優點[16-19]。本實驗中EGFP、CM-Dil標記BMSCs的效率在80% 以上，而且細胞標記后增殖能力未受明顯影響，植入體內仍具有成骨活性。通過免疫組化和熒光觀察示蹤細胞發現，植入4周后標記效果仍顯著，隨著時間延長，被標記的細胞數量逐漸減少，到12周少量BMSCs存活，大部分已被機體自身細胞取代，說明植入的BMSCs進行著和機體自身細胞相同的生命活動，從增殖分化為終末細胞發揮生理功能，到最終走向死亡，在這一過程中BMSCs不僅能分化為成骨細胞，而且可能通過旁分泌、自分泌等作用，分泌SDF-1、VEGF等細胞因子，發揮趨化、誘導分化機體自身細胞等功能，最終機體自身細胞取代BMSCs，形成新生骨組織。

本實驗分別應用EGFP和CM-Dil標記示蹤BMSCs，為探討種子細胞在體內的轉歸尋找有效的標記方法。結合兩種標記方法，發現部分BMSCs至少能存活12周以上，也證實了早期骨生成過程中種子細胞起到重要作用。比較兩種標記方法，EGFP需經過質粒構建、病毒轉染、病毒液提取和滴度測定等步驟，且標本要用免疫組織化學方法檢測，操作復雜；而CM-Dil標記操作和檢測雖然相對簡單，但CM-Dil會隨著細胞分裂導致細胞膜染料減少、熒光衰減[20]，此外骨組織鈣鹽沉積也給熒光檢測帶來了不便。因此，為探討種子細胞在組織工程骨形成中的作用及轉歸，需進一步尋找和優化標記方法。

[參考文獻]

[1]Pittenger MF，Mzckay AM，Beck SC，et al. Multilinieage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science，1999，284(5411):143-147.

[2]Muraglia A，Cancedda R，Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model[J].J Cell Sci，2000， 113:1161-1166.

[3]Oreffo RO， Triffitt JT.Future potentials for using osteogenic stem cells and biomaterials in orthopedics[J].Bone，1999，25(2 Supp1):5S-9S.

[4]Dong J，Uemura T，Shirasaki Y，et al. Promotion of bone formation using highly pure porous beta-TCP combined with bone marrow derived osteoprogenitor cells[J]. Biomaterials，2002，23:4493-4502.

[5]Janicki P，Boeuf S，Steck E，et al. Prediction of in vivo bone forming potency of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells[J].Eur Cell Mater，2011，21: 488-507.

[6]Caplan AI，Dennis JE.Mesenchymal stem cells as trophic mediators[J].J Cell Biochem，2006，98(5):1076-1084.

[7]Caplan AI.Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine[J]. J Cell Physiol，2007，213(2):341-347.

[8]Dennis JE，Haynesworth SE，Young RG，et al.Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression[J]. Cell Transplant，1992，1(1):23-32.

[9]Lane JM，Bostrom MP.Bone grafting and new composite biosynthetic graft materials[J]. Instr Course Lect，1998，47:525-534.

[10]Yuan J，Zhang WJ，Liu GP，et al. Repair of canine mandibular bone defects with bone marrow stromal cells and coral[J].Tissue Eng Part A，2010，16(4):1385-1394.

[11]Sciadini MF，Dawson JM，Johnson KD.Evaluation of bovine-derived bone protein with a natural coral carrier as a bone-graft substitute in a canine segmental defect model[J].J Orthop Res，1997，15(6):844-857.

[12]Cheng L，Fu J，Tsukamoto A，et al.Use of green fluorescent protein variants to monitor gene transfer and expression in mammalian cells[J].Nat Biotechnol，1996， 14(5):606-609.

[13]Stephens DJ，Allan VJ.Light microscopy techniques for live cell imaging[J]. Science，2003，300(5616):82-86.

[14]Chalfie M，Tu Y，Euskirchen G，et al.Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J].Science，1994，263(5148): 802-805.

[15]Wei H，Ooi TH，Tan G，et al.Cell delivery and tracking in post-myocardial infarction cardiac stem cell therapy: an introduction for clinical researchers[J]. Heart Fail Rev，2010，15(1):1-14.

[16]Kikkawa YS， Pawlowski KS. Cochlear neuronal tracing for frequency mapping with DiI，NeuroVue，Golgi Methods[J].Acta Otolaryngol Suppl，2007，(559):19-23.

[17]Li Y，Song Y，Zhao L，et al.Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI[J].Nat Protoc，2008，3(11):1703-1708.

[18]Li N，Yang H，Lu L，et al.Comparison of the labeling efficiency of BrdU，DiI and FISH labeling techniques in bone marrow stromal cells[J].Brain Res，2008，1215: 11-19.

[19]Makarenko IG，Ugrumov MV，Calas A，et al. Axonal projections from the hypothalamus to the pituitary intermediate lobe in rats during ontogenesis: DiI tracing study[J]. Brain Res Dev Brain Res，2005，155(2):117-126.

[20]Quintavalla J，Uziel-Fusi S，Yin J，et al. Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects[J].Biomatirials，2002，23(1): 109-119.

[收稿日期]2011-09-20 [修回日期]2011-11-28

編輯/張惠娟