男性雄激素源性脫發患者毛囊干細胞增殖和凋亡的初步研究

[摘要]目的：了解男性雄激素源性脫發（androgenetic alopecia，AGA）患者毛囊干細胞增殖和凋亡情況。方法：對來自15例男性AGA患者和3例正常人的頭皮，采用雙重免疫熒光的的方法檢測毛囊干細胞增殖和凋亡。結果：CK15標記的毛囊干細胞中增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA)陽性細胞率由高到低依次為：正常對照組、患者枕部、脫發過渡區和脫發區，除脫發過渡區與脫發區間比較無顯著性差異（P＞0.05）外，其它各組間比較，均有顯著性差異（P＜0.05）。各組毛囊中CK15陽性的細胞中均無TUNEL陽性細胞，TUNEL陽性細胞主要分布于內毛根鞘，總的TUNEL陽性細胞率在各組間無明顯差異(P均＞0.05)。結論：毛囊干細胞增殖活性下降可能參與男性AGA的脫發過程。

[關鍵詞]雄激素源性脫發;毛囊干細胞;增殖;凋亡

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）03-0403-03

The proliferation and apoptosis of hair follicle stem cells in hair follicle in male patients with androgentic alopecia

DONG Jia-hui，WAN Miao-jian，FENG Zhiying，LI Ying，LI Xiaoxin，GONG Zijian，LAI Wei，JI Bing

(Department of Dermatology，The 3rd Affiliated Hospital of Sun Yat-San University，Guangzhou 510630，Guangdong，China)

Abstract: Objective To investigate the proliferation and apoptosis of hair follicle stem cells in male patients with AGA. Methods The follicle from different scalp areas (occipital of non-hair loss， hair loss transition and hair loss zone ) of 15 AGA patients and 3 normal scalp. Using double immunofluorescence method to study the proliferation and apoptosis of hair follicle stem cell in scalp different regions. Results In hair follicle bulge area of normal group and patients' occipital area，there is no significant difference between the percentage of PCNA-positive cells in CK15 positive cells (P＞0.05)，they both are higher than that of the hair loss area and the hair loss transition area(P＜0.05). There are no TUNEL-positive cells in the CK15-positive cells in each group， TUNEL-positive cells are mainly distributed in the inner hair follicle root sheath， The rate of TUNEL-positive cells is no significant difference among the groups (P＞0.05). Conclusion Decrease of the proliferation activity of the hair follicle stem cells may be involved in the pathogenesis of male patients with AGA.

Key words: AGA; hair follicle stem cells; proliferation; apoptosis

AGA是一種常見的進行性脫發性疾病，不僅影響患者容貌，而且給患者心理和社交造成一定的影響[1]。目前，AGA發病的分子機理尚未完全闡明。

毛囊干細胞定居于毛囊外毛根鞘的隆突部位[2]，除了維持毛囊生長周期循環，還可更新表皮和皮脂腺[3-4]。正常情況下，毛囊干細胞數量基本保持恒定[5]，但在病理狀態下，毛囊隆突部位微環境遭到破壞，毛囊干細胞數量和分裂增殖活性可能會發生改變而引起脫發，如紅斑狼瘡[6]和毛發扁平苔癬[7]。既往雖有對AGA患者毛囊細胞增殖和凋亡情況的研究報道，發現受累毛囊細胞有增殖活性的下降和凋亡的現象[8-9]，但毛囊干細胞的增殖和凋亡情況不得而知。因此，本文通過研究AGA患者毛囊干細胞增殖和凋亡情況，初步了解毛囊干細胞在AGA患者中的受累狀況，為進一步闡明AGA發病機制奠定基礎。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 受試者納入標準

1.1.1.1 AGA組：經臨床確診的男性AGA患者，年齡18～50歲，近3個月未系統使用抗雄激素藥物和局部使用任何育發類產品或藥物治療，頭皮正常完整，無細菌、真菌等感染性疾病及皮炎濕疹等炎癥性皮膚病。

1.1.1.2 對照組：年齡在18～50歲，均為男性，本人及家族均無AGA病史；近3個月未系統使用性激素藥物，頭發生長正常，頭皮正常完整，無細菌、真菌等感染性疾病及皮炎濕疹等炎癥性皮膚病。

1.1.2 受試者排除標準：頭部合并有其他皮膚疾病者；合并有其他嚴重的心肺肝腎疾病、精神病、糖尿病及自身免疫性疾病等者；其他原因引起的脫發者；不合作或資料不全者；未能簽署知情同意書者。

1.1.3 受試者一般資料：AGA患者均為廣州粵秀整形機構樂鬃毛發移植中心接受毛發移植的患者，共15例，均為男性，以Hamilton 分型為Va型，年齡23～48歲，平均29.0±2.1歲。3例正常頭皮均選自中山大學附屬第三醫院顱腦手術患者，均為男性，年齡28.0±1.3歲。該研究經中山大學附屬第三醫院倫理委員會通過，倫理批號：【2010】2-4號。

1.1.4 受試者取材部位選擇及方法：AGA患者頭皮分枕部非脫發區、脫發過渡區、脫發區三個區域，每個區域用同一鉆孔刀（slot pouch ?3mm，Micro-Tools Europe，Germany）各取3塊的頭皮組織，每塊大小約3mm×3mm×5mm。對照組取與脫發區相對應部位的頭皮。并對取出的標本進行預處理，把頭皮組織分離成只含1～2根毛發的小組織。

1.1.5 實驗分組 分正常對照組、AGA枕部非脫發區組、AGA脫發過渡區組及AGA脫發區組。

1.2 實驗方法

1.2.1主要試劑和儀器：CK15單克隆抗體（小鼠抗人，Santa Cruz，USA），PCNA多克隆抗體（兔抗人，Santa Cruz，USA），Texas Red熒光二抗 （山羊抗小鼠，Proteintech ，USA），FITC熒光二抗（山羊抗兔， Proteintech ，USA），TUNEL試劑盒（Sigma，USA）；熒光顯微鏡（Olympus 81i，Japan）。

1.2.2 毛囊干細胞增殖活性和凋亡觀察

1.2.2.1 毛囊干細胞的鑒定[10]：毛囊干細胞位于毛囊隆突部。本研究采用K15作為毛囊干細胞鑒定的標記物，如細胞漿染成紅色即為毛囊干細胞。

1.2.2.2 毛囊干細胞增值活性觀察：對預先處理的毛囊組織進行3μm連續切片，切片時以毛囊縱軸為方向。按照試劑盒操作說明對切片進行雙重免疫熒光染色，對各組毛囊的CK15染色陽性的細胞中PCNA陽性細胞進行觀察記數。

1.2.2.3 毛囊干細胞凋亡觀察：操作方法同前。對對各組毛囊的CK15染色陽性的細胞中TUNEL陽性細胞進行觀察記數。

1.2.4免疫熒光結果判定和記錄：CK15免疫熒光陽性結果判定：細胞胞漿出現紅色熒光。PCNA免疫熒光陽性結果判定：細胞胞核出現綠色熒光。TUNEL陽性結果判定：細胞胞核出現綠色熒光。每張切片用Olympus顯微鏡在圖像分析系統下照相和計數，分別計算毛囊隆突部位CK15陽性細胞中PCNA陽性細胞的百分比和TUNEL陽性細胞數及總的陽性率。正常對照組和患者不同區域各觀察5個毛囊，每組毛囊結果以均數±標準差(x±s)表示。

1.3 統計學分析：數據分析與統計學處理采用SPSS16.0完成。選單因素方差分析，結果有統計學意義，再進行兩兩比較，P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 毛囊干細胞的增殖情況：各組毛囊隆突部位CK15陽性細胞中均有不等量的PCNA陽性細胞（圖1a～d），PCNA陽性細胞/CK15陽性細胞百分比見表1和圖2。

從表1可以看出，CK15陽性細胞中PCNA陽性細胞率由高到低依次為：正常對照組、患者枕部非脫發區組、脫發過渡區組、脫發區組，四個組間比較有顯著性的差異（F=12.046，P＜0.001）；兩兩比較，除脫發過渡區組與脫發區組間比較無顯著性差異（P＞0.05）外，其它各組間比較，均有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 毛囊干細胞的凋亡情況：在各組毛囊中，CK15陽性細胞中均未見到有TUNEL陽性的細胞，但在隆突部可見TUNEL陽性細胞。各組毛囊隆突部位TUNEL陽性細胞率見表2和圖3，四組間比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 毛囊終生經歷著生長期、退行期、靜止期然后再進入下一個生長期的周期性生長過程。毛囊這種周期性的變化與毛囊干細胞周期性的分裂、增殖、分化和毛囊隆突部位以下細胞的周期性爆發式的凋亡密切相關[11]。

3.2 本研究表明，正常對照組和AGA患者非脫發區枕部毛囊干細胞增殖率要明顯高于脫發過渡區和脫發區，說明AGA患者，毛囊干細胞增殖活性在一定程度上受到抑制。國外Mobini N等[7]研究發現，在扁平苔癬引起的脫發患者中，也發現處于增殖的毛囊干細胞數量明顯減少，并認為這可能是引起脫發的原因；國內學者邢書亮等[12]報道，在脂溢性脫發患者的脫發區，其毛囊干細胞數量減少；但國外Luis A.G等[13]研究發現，AGA患者毛囊干細胞數量并沒有減少，引起其脫發的是具有分化為毛囊能力的CD-200和CD-34陽性的毛囊干細胞數量減少。因此，筆者認為男性AGA患者，由于毛囊干細胞增殖活性的下降，可能導致具有分化毛囊的毛囊干細胞數量減少，是引起AGA脫發的可能原因。至于為何引起脫發區和脫發交界區毛囊干細胞增殖活性下降，原因不清楚，筆者認為可能與這些部位的毛囊干細胞生存的微環境受影響有關，研究發現， AGA患者中，脫發區毛囊具有輕度慢性炎癥及其周圍的纖維化[14]，這可能影響到毛囊干細胞生存的微環境。

3.3 本研究還發現，不論是正常對照組，還是AGA患者不同頭皮區域的毛囊中均未見到有CK15陽性的毛囊干細胞中有TUNEL陽性的細胞，這說明，在AGA患者中，脫發的機制可能與毛囊干細胞的凋亡無關。此外，筆者也發現，在各個毛囊組織中，存在數量不等TUNEL陽性細胞，各組毛囊的TUNEL陽性細胞率間無顯著性差異，TUNEL陽性細胞主要散在分布于毛囊中段以上的內毛根鞘，這與Prieto等[9]報道的結果基本一致，但與Cowper 等[10]研究的結果存在差異；至于其原因，筆者認為可能與人種、病情嚴重程度等有關。

總之，本研究結果表明，AGA患者中，脫發區和交界區毛囊干細胞存在增殖活性下降，沒有發現毛囊干細胞凋亡現象。毛囊干細胞增殖活性下降的機制及其是否參與AGA脫發的過程，值得進一步研究。

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[收稿日期]2011-10-13 [修回日期]2012-01-18

編輯/張惠娟