通過RNAi技術抑制楊樹c3h基因表達提高糖轉化效率

楊少宗，柳新紅，趙樹堂，王敏杰，盧孟柱*

（1 中國林業科學研究院林業研究所 國家林業局林木培育重點實驗室，北京 100091；2 浙江省林業科學研究院，杭州 310023）

通過RNAi技術抑制楊樹c3h基因表達提高糖轉化效率

楊少宗1,2，柳新紅2，趙樹堂1，王敏杰1，盧孟柱1*

（1 中國林業科學研究院林業研究所 國家林業局林木培育重點實驗室，北京 100091；2 浙江省林業科學研究院，杭州 310023）

利用克隆得到的毛白楊c3h1基因構建其RNAi抑制表達載體，通過根癌農桿菌介導的葉盤法轉化銀腺楊無性系84 K，Realtime PCR檢測表明其轉基因株系323、325和322中c3h1基因表達量較野生型植株分別下調89.04%、82.22%和68.38%；莖橫切片組化染色和顯微結構觀察表明轉基因植株木質部發育和木質素沉積方式發生了改變；木質素、纖維素含量測定及苯酚—硫酸法總糖含量與HPLC法可溶性總糖和單糖含量檢測結果表明：轉基因植株木質素含量平均降低23.00%，最高可達39.71%；酸前處理效率最高提高了41.39%；未經酸處理直接酶解的糖化效率是對照植株的2.34 ～ 2.72倍，322株系和323株系比對照植株經酸前處理后再酶解的糖化效率高出81.18%和375.53%。

RNA干擾；楊樹；c3h；木質素；糖轉化效率

隨著人們對環境質量和生活品質的關注以及保障能源安全的需求，生物質能源越來越受到公眾和科學界的重視[1～3]。生物乙醇是全球最廣泛利用的生物燃料[4～7]，但由于目前生產生物乙醇的原料主要來自于谷物等糧食作物[8]，在保證糧食安全的前提下解決能源危機問題，必然聚焦于林木生物質能源[9～10]。作為木本模式植物的楊樹由于其分布廣、實用性強、無性繁殖能力強，加之其速生豐產、遺傳背景清楚等優勢，無可爭議地成為林木生物質能源研究的首選[11～13]。林木生物質能源發展面臨的最大技術難題是木質纖維素的水解[14～19]，由于木質素與纖維素的緊密結合和對其保護作用是導致纖維素資源利用的主要障礙[9,20～22]。降低木質素含量或改變其結構，將有利于纖維素的解聚和糖轉化效率的提高[23～24]。

C3H屬細胞色素P450類酶，是木質素生物合成途徑中苯丙烷途徑的限速酶[25～28]，決定木質素單體的碳源流向。已報道的C3H分子量約為58 kDa，隨不同來源稍有差異[29～30]。Coleman等[31]利用RNAi技術抑制楊樹中C3H的表達，結果木質素總含量顯著下降，且伴隨著S/G比值改變。本研究通過RNAi技術抑制楊樹C3H基因表達，獲得低木質素含量、高糖轉化效率的轉基因植株，為生物質能源楊樹的分子遺傳育種和更高效地開發利用林木生物質能源提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 毛白楊、84K楊無菌苗均為中國林科院林業所生物技術實驗室保存并繁殖；大腸桿菌DH5α、農桿菌GV3101菌種及pBIRNAi質粒均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑 限制性內切酶及DNA連接酶購自NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Axygen公司；pGEMa-T Easy Vector System購自Promega公司；Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；纖維素酶Celluclast 1.5 L和纖維素二糖酶Novozyme 188購自Sigma公司；其它試劑購自國內有關廠家；PCR引物合成及測序由Introvigen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 毛白楊總RNA的提取 取毛白楊形成層材料，按Qiagen RNA提取試劑盒步驟操作提取總RNA。

1.2.2 RT-PCR合成毛白楊cDNA第一鏈 cDNA第一鏈合成按SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR操作步驟進行

1.2.3 毛白楊c3h1基因全長cDNA的克隆 以紫花苜蓿（Medicago sativa cv. regen）木質素合成關鍵酶C3H（香豆酰莽草酸3-羥化酶）基因為信息探針，根據電子克隆的序列拼接結果設計PCR特異引物，以合成的毛白楊cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增反應，PCR擴增的條件為：94℃4 min預變性，（94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s）共30個循環，72℃延伸7 min。PCR產物膠回收按Axygen AxyPrep DNAgel Extraction Kit 操作說明，回收純化的c3h1基因PCR產物亞克隆于pGEM-T Easy載體，質粒提取按Axygen AxyPrep Plasmid miniprep Kit操作流程進行。

圖1 c3h1基因的RNAi抑制表達載體pBIRNAi-c3h1R-i-c3h1L示意圖Figure 1 Scheme of pBIRNAi-c3h1R-i-c3h1L vector

1.2.4 c3h1基因RNAi抑制表達載體的構建及轉化 根據已獲得的毛白楊c3h1基因序列和其他物種之間同源基因的多重比對分析，選取經檢索比對后的354 bp保守序列作為目的片段，擴增帶有雙酶切位點（BamH I/Pac I和Sac I/Age I）的正、反向片段分別連至pBIRNAi表達載體，在含有50 mg/L卡那霉素的LB固體平板上篩選抗性質粒，經PCR和雙酶切鑒定得到c3h1基因的RNAi抑制表達載體，命名為pBIRNAi-c3h1 R-i-c3h1L（圖1）。

將該質粒用電擊法導入農桿菌GV3101菌株的感受態細胞，經PCR鑒定篩選出轉化子。通過根癌農桿菌介導的RNAi抑制表達載體pBIRNAi-c3h1R-i-c3h1L葉盤法轉化銀腺楊無性系84K，經農桿菌的培養、侵染、共培養、選擇培養、繼代選擇培養和生根培養，同時以轉化pBIRNAi空載體和未做侵染的葉片外植體作為對照，獲得卡那霉素抗性植株移栽溫室。

1.2.5 轉基因植株的PCR篩選 采用CTAB法提取轉基因植株和對照植株扦插繁殖新萌枝條葉片基因組DNA，以NPT-II基因及正、反向插入片段基因特異引物PCR檢測。PCR反應程序為：94 oC預變性4 min；（94oC變性30 s，60oC退火30 s，72oC延伸30 s）共30個循環；72oC延伸5 min。

1.2.6 Realtime PCR檢測c3h1基因的轉錄表達量變化 取扦插后轉基因植株和對照植株新萌枝條葉間隔期指數PI = 3 ～ 5間的莖段，以泛素蛋白基因ubiquitin作內對照，定量PCR反應按照SYBR? Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑盒提供的方法進行。

1.2.7 轉基因植株與對照植株莖橫切片組化染色 取PI = 3 ～ 5間莖段，冰凍切片法觀察轉基因植株與對照植株經Wiesner組化染色的莖橫切顯微結構。

1.2.8 轉基因植株與對照植株木質素、纖維素、半纖維素含量測定 意大利VELP公司FIWE6纖維素測定儀，利用重量法通過計算得到樣品中纖維素、半纖維素和木質素的含量。

1.2.9 苯酚-硫酸法測定轉基因植株與對照植株的可溶性總糖及糖轉化效率 樣品具體處理方法（圖2）中B、C、D、E處理組。其中，酶水解所用的酶為纖維素酶Celluclast 1.5 L和纖維素二糖酶Novozyme 188。

1.2.10 HPLC法測定轉基因植株與對照植株中的單糖含量 樣品具體處理方法（圖2）中A、C、D、E處理組。色譜分析條件為Waterson Super D糖柱 250 mm×4.6 mm 10 μL；流動相為乙腈：水 = 70：30（超聲波脫氣，并經0.45 μm濾膜過濾）；流速1.00 mL/min；進樣量20 μL；柱溫35 oC。

圖2 不同測定組的樣品處理方法Figure 2 Different treatments for five groups of samples

2 結果與分析

2.1 毛白楊c3h1基因cDNA克隆與分析

根據電子克隆，通過RT-PCR的方法獲得毛白楊c3h1基因的cDNA克隆，其完整的開放讀碼框（ORF）1 527 bp共編碼508個氨基酸。

2.2 c3h1基因RNAi抑制表達載體pBIRNAi-c3h1R-i-c3h1L的構建和鑒定

重組質粒pGEM-T-c3h1（連有c3h1 cDNA的T載體）、pGEM-T-c3h1R（連有c3h1正向片段的T載體）、pGEM-T-c3h1L（連有c3h1反向片段的T載體）、pBIRNAi-c3h1R-I（連有c3h1正向片段的pBIRNAi載體）和pBIRNAi-c3h1R-i-c3h1L（含c3h1目標片段發夾結構的表達載體）的PCR、雙酶切鑒定和測序結果表明，攜帶毛白楊c3h1基因目標片段發夾結構的RNAi抑制表達載體構建成功（圖3）。

圖3 pBIRNAi-c3h1R-i-c3h1L載體構建過程中PCR產物及雙酶切結果電泳圖Figure 3 Electrophoresis of PCR products and recombinant plasmid DNA digested by BamH I/Pac I and Sac I/Age I during the construction of pBIRNAi-c3h1R-i-c3h1L

2.3 c3h1基因RNAi抑制表達載體pBIRNAi-c3h1R-i-c3hL遺傳轉化

根癌農桿菌介導的c3h1基因RNAi抑制表達載體pBIRNAi-c3h1R-i-c3hL遺傳轉化銀腺楊無性系84 K，轉基因植株和對照植株移栽溫室后經低溫誘導扦插繁殖，共得到8個轉基因株系25個單株。

圖4 楊樹葉盤法遺傳轉化及溫室栽培Figure 4 Poplar genetic transformation via leaf disc method and propagation in greenhouse

2.4 轉基因植株的NPT-II基因及目的基因片段PCR分析

8株轉基因陽性植株和pBIRNAi-c3h1R-i-c3h1L質粒均擴增出一條750 bp的特征條帶，而野生型84K楊植株呈PCR陰性反應。以pBIRNAi載體上內含子序列intron down和c3h1基因特異序列為c3h1 FP引物對擴增正向目的片段，intron up和c3h1 RP為引物對擴增反向目的片段，轉基因陽性植株均擴增出一條400 bp的特征條帶，而野生型和轉空載對照植株呈PCR陰性反應（圖5）。

圖5 轉c3h1基因植株NPT-II基因和c3h1基因特異引物PCR檢測結果電泳圖Figure 5 c3h1 transgenic plants screened by PCR with NPT-II and c3h1 gene-specific primers

2.5 轉基因植株基因表達量

轉基因株系中c3h1基因表達量下調由高到低順序為323(0.1096)＞325(0.1778)＞322(0.3162)，較野生型ck植株分別下調了89.04%、82.22%和68.38%。

2.6 莖橫切冰凍切片顯微結構觀察

圖6 莖橫切片（20×）顯微結構Figure 6 Microscopic structure of stem cross-section

與野生型對照組相比，轉基因植株的木質部細胞層數增多，但細胞相對較小，導管發育過程中出現管壁塌陷現象，而對照植株則較為規則；野生型植株韌皮部發育正常，韌皮纖維細胞數量較多，形狀規則，染色較均一，而轉基因植株的韌皮部較野生型少，韌皮纖維細胞數量少，染色區域不規則；轉基因植株木質部細胞次生壁出現不規則加厚現象，而對照植株次生壁的木質素沉積則較為均勻（圖6）。

2.7 轉基因植株木質素、纖維素、半纖維素含量

各株系酸性木質素含量為323（10.31 mg/g） ＜ 325 （11.74 mg/g） ＜ ck（17.10 mg/g） ＜ 322（17.45 mg/g），323和325株系較野生型分別降低了39.71%和31.35%；轉基因株系纖維素含量均高于野生型對照組（圖7）。

2.8 轉基因植株總糖及糖轉化效率

以72%硫酸處理后再稀酸高溫水解得到的糖作為細胞壁物質總糖，分析不同處理條件下各株系的糖轉化效率。結果表明：經酸前處理的糖轉化效率325 （13.46%）＞323（9.70%）＞ck（9.52%）＞322（7.18%）；酸處理后再經纖維素復合酶水解，各株系糖轉化效率為325（25.76%）＞ck（23.38%）＞322（11.32%）＞323（3.80%）；未經酸處理直接酶解的糖轉化效率均明顯高于對照植株：322（20.51%）＞323（18.07%）＞325（17.59%）＞ck（7.53%），322和323株系比經酸處理后再酶解的相應株系糖化效率高出81.18%和375.53%（圖8）。

圖7 不同株系木質素、纖維素和半纖維素含量分析Figure 7 Content of lignin, hemicellulose and cellulose in different lines

2.9 轉基因植株HPLC法可溶性總糖及單糖含量

4組不同方法處理的樣品經HPLC測定，可溶性總糖含量為：322（12.18 mg/g）＞ck（11.01 mg/g）＞323 （10.86 mg/g）＞325（10.08 mg/g）；經酸前處理的單糖含量為325（138.26 mg/g）＞323（135.02 mg/g）＞322 （108.16 mg/g）＞ck（89.54 mg/g）；酸處理后再酶水解的單糖僅有葡萄糖322（43.99 mg/g）＞325（43.71 mg/g）＞323（38.59 mg/g）＞ck（37.77 mg/g）；未經酸處理直接酶解得到的單糖均高于對照植株：323（87.77 mg/g）＞322（80.11 mg/g）＞325（57.09 mg/g）＞ck（51.96 mg/g）。未經酸前處理直接酶解的323和322株系葡萄糖的得率與對照植株ck相比，分別提高了57.42%和47.91%，比經酸處理后再酶解的相應株系高出73.70%和43.17%，而對照植株則無顯著變化（圖9）。

圖8 不同株系糖化效率Figure 8 Histogram of saccharification efficiency of c3h1 transgenic lines

圖9 各株系不同處理組可溶性總糖和單糖含量測定Figure 9 Soluable sugar and monomeric sugar in c3h1 transgenic lines by the phenol-sulfuric acid assay and HPLC

3 討論

（1）對扦插繁殖后的轉基因植株323、325和322三個株系和對照植株的Realtime PCR定量檢測和莖橫切組化染色及顯微結構觀察結果表明，c3h1基因受抑制的轉基因植株次生木質部細胞層數增多，暗示其可能的早期生長加速，但由于細胞較小，故外部形態未見明顯變化；導管壁的塌陷和次生壁的區域性加厚顯示轉基因植株木質素沉積方式發生了改變[32]。

（2）木質素、纖維素和半纖維素含量的測定結果表明，轉基因植株木質素含量的降低與c3h1基因的轉錄表達量大體一致，木質素降低的轉基因植株均表現為纖維素含量較高，而半纖維素含量無明顯變化。抑制其他基因如PAL、C4H、C3’H等基因表達多表現為木質素含量的降低和組成成分比例的改變[29,31～35]，反義抑制煙草omt基因木質素降低了62%，但在楊樹中木質素含量未發生改變，楊樹中木質素含量下調最高約45%的為轉4cl基因反義抑制結構。323株系下調了39.71%，與抑制其他木質素合成關鍵酶基因相比效果較好，故RNAi抑制C3H1基因表達可有效降低楊樹木質素含量。

（3）總糖含量及糖轉化效率的分析表明，木質素含量的降低與纖維素的糖轉化效率的提高緊密相關。酸前處理水解的底物主要為半纖維素，經酸前處理去除大部分半纖維素，殘留物再經酶水解的水解效率代表了纖維素的糖轉化效率。酸前處理解除了半纖維素與纖維素的結合，纖維素晶狀結構發生解聚，增加了酶與纖維素的可及度，酶解效率增高。未經酸前處理直接酶解的轉基因植株糖化效率明顯高于對照植株，甚至高于經酸前處理后再酶處理的糖化效率，說明木質素含量的降低使得酶與纖維素的接觸幾率更大，酶解效率更高。

（4）可溶性總糖和單糖含量HPLC檢測結果表明，木質素含量的降低導致細胞可溶性糖含量的增加及纖維素糖轉化效率的提高。細胞壁物質經酸處理后酶解得到的葡萄糖來自于纖維素的酶水解，其含量多少代表了纖維素的糖化效率高低。未經酸前處理直接酶解的轉基因株系葡萄糖得率比對照植株高，323株系比經酸處理后再酶解的相應株系高出73.70%，說明了木質素含量的降低可能引發細胞中可溶性糖和纖維素的代償性增加，由于木質素含量降低，減輕了對纖維素的束縛作用，游離的纖維素增多，酶的可及度增大，使得酶解糖化效率顯著提高。木質素含量最低的轉基因323株系，表現為基因表達量下調最多，細胞壁總糖、可溶性總糖及纖維素的糖化效率最高。

本研究結果表明，通過基因調控降低木質素含量，將有可能在一定程度上打破細胞壁物質的糖化作用障礙，使得轉基因植株的可溶性糖含量升高，纖維素的酶解糖化效率增強。轉基因株系323的優良表現，尤其是其不經酸前處理直接酶解即可達到經酸前處理后再酶解所能達到的水解效率，為更好地利用木質纖維素生物質能源提供了一個有積極意義的信息。

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Downregulation of Coumaroyl Shikimate 3-hydroxylase in Poplar by RNAi Technique

YANG Shao-zong1,2，LIU Xin-hong2，ZHAO Shu-tang1，WANG Min-jie1，LU Meng-zhu1*
（1. Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Beijing 100091, China; 2. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China）

Efficient hydrolysis of lignocellulose is the biggest technical challenges on forest bioenergy development due to lignin hindrance to bioconversion from lignocellulose to ethanol in poplar. Experiments were conducted to genetically modify poplar to decrease lignin content in order to enhance fermentable sugars which can be converted to ethanol. c3h1 gene in Populus tomentosa was cloned and its RNAi vector expressing ds-RNA was constructed. 8 transgenic lines harboring the RNAi constructs were obtained via the leaf-disc method and propagated by cutting for each lines in the greenhouse. The transcription level of c3h1 in RNAi inhibition transgenic lines analyzed by real-time PCR decreased 89.04%, 82.22% and 68.38% in the RNAi inhibition line 323, 325 and 322 compared with the control. Stem cross-section staining and microstructure observations showed that the xylem development and lignin deposition pattern in transgenic plant changed. Transgenic plants with lowest lignin content generally matched with the highest content of cellulose and soluble total sugars and the highest sacchrification efficiency. The results indicated that lignin is probably the major factor in recalcitrance of cell walls to saccharification. Moreover, it demonstrated that genetic reduction of lignin content effectively overcame cell wall recalcitrance to bioconversion.

RNAi; poplar; c3h; lignin; sacchrification

S718.4

A

1001-3776（2012）03-0001-08

2011-12-20；

2012-03-10

863項目“高產優質多抗楊樹分子與細胞高效育種技術及品種創制”（2006AA100109-1），863項目“特色植物高效轉化技術的建立”（2007AA10Z182），863項目“楊樹木材發育的基因調控研究”（2006AA10Z122）

楊少宗（1974-），男，安徽阜陽人，助理研究員，從事林木遺傳育種研究；*通訊作者。