珍稀瀕危植物裸果木RAPD反應體系優化研究

王 靜，王海芳，花立民，馬喜迎，王亮亮

（1.蘭州職業技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學 草業學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省小隴山林業實驗局，甘肅 天水 741020）

裸果木（Gymnocarpos przewalskii）隸屬石竹科（Caryophyllaceae）裸果木屬（Gymnocarpos），主要分布在新疆南部山區、甘肅河西走廊、青海西部、內蒙古西部、寧夏東南部（沙坡頭地區）［1］。裸果木是古地中海荒漠殘遺種，屬于珍稀植物，為1987年我國首批公布的國家二級保護植物，1997年被定為一級保護植物。對研究我國西北和內蒙古荒漠的發生、發展、氣候變化及旱生植物區系成分的起源有著非常重要的科學價值［2］。近年來，由于生存環境的惡化，及自身生物學因素，又遭樵采和駱駝啃食等人類各種經濟活動的干擾和破壞，裸果木的種群數量急劇減少，分布區已日益縮小和片段化［3］。開展種群遺傳學研究，制定相關的保護計劃，是保護其的有效途徑。

目前有關裸果木的相關研究主要集中在形態解剖學［4，5］、生理生態［6－8］、組織培養和擴繁［9］以及化學成分研究［10］等方面，有關分子水平的研究較少。隨機擴增多態性DNA（RAPD）技術是以PCR為基礎的一種分子標記，具有操作簡便、快速、低成本、多態性檢出率高等優點［11］，在遺傳多樣性評價、物種分類與鑒定、遺傳圖譜構建等方面有廣泛的應用［12，13］，由于RAPD引物的隨機性及較低的退火溫度等導致的條件不穩定等，影響了該技術的應用。在應用該技術時，通常需要對其反應體系進行優化，以提高其穩定性。為此進行了裸果木RAPD體系的構建和優化試驗，為開展裸果木種質資源保護和管理提供有價值的科學參考。

1 材料和方法

1.1 材料

自2008～2009年10月，采集了甘肅省肅北縣紅柳峽口子干溝一帶裸果木葉片若干。

成立護理質量綜合評價指標體系課題小組，護理部主任負責小組主持工作，小組成員包括3名護理質量管理專家、2名信息工程師、3名臨床護士長、3名護理骨干共11人；小組主要任務為提煉護理質量敏感指標、組織專家進行指標咨詢及篩選、構建護理質量控制指標體系并嵌入護理信息系統、推進以指標監測為主線的護理質量控制。

試劑40個10bp大小的RAPD隨機引物、Taq酶、10×Taq緩沖液、Mg2＋、dNTP均購自大連寶生物有限公司；瓊脂糖、DNA Marker等均購自天為時代科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 裸果木DNA提取及濃度、純度檢測 DNA提取按改良CTAB法進行［14］。在紫外分光光度計上，檢測DNA樣品的濃度和純度。

2.2.3 RAPD反應體系的穩定性檢測結果 以不同裸果木個體為實驗材料，以多態性較好的引物（0～24），對建立的反應體系的穩定性進行檢驗，所選擇的引物可以擴增出清晰、重復性好的條帶，初步表明優化的體系及反應參數是穩定可靠的（圖8）。

我們黨是一個敢于堅持真理，勇于修正錯誤的黨。我們黨在改革開放的過程中逐漸認識到，要高度重視人民利益，高度重視人民生活的改善，堅決破除一切不合時宜的思想觀念和阻礙國家民族發展的一切體制機制障礙，讓一切創造社會財富的源泉充分涌流。貧窮不是社會主義，人民幸福是社會主義優越性的本質體現。

Client/Server架構的數據庫，可根據Client查詢請求返回相應的結果集，避免了在網絡上傳播無效數據，有效地利用了網絡帶寬，提高了系統性能。本系統采用了流處理機制(Stream)對數據集對象(ADO)序列化和反序列化，利用AdoDataSet數據集SaveToFile方法將數據集保存到文件中，再通過內存流(Mem?oryStream)緩存在內存中，使用ZIP壓縮算法在壓縮內存流中的數據后返回給Client，Client收到響應數據后進行反序列化即可還原出該數據集對象(ADO)。由于網絡上傳輸的數據是經過壓縮的，進一步提高了系統性能。

對于政府在“河長制”這一政策的宣傳力度上，認為“一般，宣傳效果只針對相關工作人員”的公眾占比半數以上，其次是“不滿意，周圍人很少關注政策內容及實施效果”，而公眾認為“滿意，宣傳到位且形式多樣”的占比較少，值得關注的是還有部分公眾持“對此不關注不了解”態度。因此，在“河長制”宣傳工作上，還有很大的改進空間。

2 結果與分析

2.1 提取的模板DNA濃度和質量

2.2.1 反應體系優化結果 （1）DNA模板濃度 根據預實驗設置了0.4、2.0、4.0、6.0、8.0ng/μL 5個DNA模板濃度梯度。模板DNA用量為10ng時，擴增條帶暗淡；之后，隨著模板DNA用量的增加（2.0～6.0ng/μL），條帶逐漸清晰、明亮，當模板DNA用量4.0ng/μL時，擴增效果最佳；其大于6.0ng/μL時，條帶數目逐漸減少。這表明模板DNA用量過少時，擴增產物太少且條帶也暗淡（圖2）。模板DNA用量較大時，由于“平臺效應”表現為條帶數量逐漸減少。據此實驗確定裸果木多態性研究的RAPD反應合適的DNA模板濃度為4.0ng/μL（100ng）。

圖1 DNA電泳檢結果Fig.1 The DNA electrophoretic bands extracted from leaves

2.2 RAPD反應體系優化和程序確立

對提取的裸果木基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。DNA條帶明亮，無嚴重拖尾和降解現象，可見所提取的基因組DNA較完整，質量較高，能應用于RAPD反應分析（圖1）。與λDNA的濃度梯度進行比較，估測出DNA的濃度為100ng/μL左右。經紫外分光光度計檢測，D260mm/D280mm比值均在1.6～1.9。

（2）Mg2＋濃度 設置了1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 5個 Mg2＋濃度梯度，設計的 Mg2＋濃度梯度均能擴增出條帶，但Mg2＋濃度2.0mmol/L時的擴增效果最好；當Mg2＋濃度減少時，擴增條帶數目減少且亮度減弱；相反其用量增加時，擴增的條帶也表現出了相同的規律。這可能及Mg2＋及激活Taq酶的活性有關系，Mg2＋濃度過低時，Taq酶的活性難以完全被激活，導致擴增效率降低；而當Mg2＋濃度過高時，Mg2＋會大量鰲合dNTP，從而降低了PCR擴增產物的量（圖3）。因此實驗確定裸果木多態性研究的RAPD反應合適的Mg2＋濃度為2.0mmol/L。

（2）退火溫度 設定了32、34、36、38℃共4個溫度梯度。當退火溫度較低時（32、34℃），擴增條帶數少且模糊；36℃時擴增的條帶最為清晰，分辨率最高；當退火溫度高于36℃時，條帶數目減少的同時，分辨率也明顯下降（圖6）。因此實驗確定合適的退火溫度為36℃。

（3）dNTP濃度 實驗設置了0.1、0.5、0.9、1.2 mmol/L 4個dNTP濃度梯度。當dNTP濃度小于0.5mmol/L時，擴增條帶數目少且亮度弱；在0.5 mmol/L時，擴增條帶清晰明亮，PCR反應充分；而當dNTP濃度為0.9、1.2mmol/L時，擴增條帶分辨率下降，出現彌散現象，擴增的特異性下降（圖4）。因此實驗確定裸果木多態性研究的RAPD反應合適的dNTP濃度為0.5mmol/L。

（4）引物濃度RAPD反應中若引物濃度過高，會導致引物與模板之間的錯配，同時還會增大引物二聚體的形成幾率；而引物濃度過低會導致擴增不充分，甚至不能擴增。RAPD反應中，設計了0.1、0.2、0.3、0.5μmol/L等4個引物濃度梯度，0.1～1.0μmol/L均可擴增出條帶，當引物濃度低于0.5μmol/L時，擴增條帶數目少而暗弱，甚至有的位點觀測不到；當引物濃度在0.5μmol/L時，擴增條帶清晰明亮，效果最佳，且重復性好；當引物濃度較大時，由于非特異性擴增，導致分辨率嚴重下降，出現了彌散現象。因此實驗確定的裸果木多態性研究的RAPD反應合適的引物濃度為0.3μmol/L。

2.2.2 RAPD方法擴增程序的優化 （1）變性時間實驗依次設置了30、40、50s3個變性時間。隨著變性時間的延長，擴增條帶逐漸穩定，在40s擴增出的條帶清晰（圖6）。

大數據背景下，企業會計信息不僅完善了數據共享功能，在各企業單位的具體交流上也密切起來，實現了企業及單位共享信息平臺建設，解決了財務信息“孤島”的問題。同時，大數據背景下的企業會計信息化建設能提高企業的重視程度，減少中小企業會計信息化實現程度參差不齊的問題，實現企業各部門、企業與企業間良好的信息共享和運行循環。

1.2.2 RAPD－PCR反應體系的建立及優化 PCR反應在PE480型DNA擴增儀中進行。參考一般反應體系［15］，分別在25μL反應體系中加入模板 DNA、Mg2＋、dNTP、Taq酶、引物和ddH2O。之后蓋上蓋子振蕩混勻。設置94℃預變性5min，30個循環進行94℃變性45s，36℃退火40s，72℃延伸1min，72℃延伸10min。

優化RAPD反應體系時，固定擴增程序，每次改變RAPD反應中的1個參數，以確定該參數對RAPD結果的影響。篩選的參數包括：（1）模板DNA質量濃度；（2）dNTPs濃度；（3）引物用量；（4）Mg2＋濃度。同時對擴增程序中的退火溫度和變性時間也進行優化，以找到合適的反應條件。

圖8 優化體系下12個樣品擴增的PCR結果（0～24）Fig.8 The PCR results of 12specimens with peimer 0～24 and optimized reaction system

最終確定的RAPD反應為：在25μL反應體系中，模板DNA用量為4.0ng/μL，引物濃度為0.3 μmol/L，dNTP濃度為0.5mmol/L，Mg2＋濃度為2.0 mmol/L，Taq酶用量為1U，ddH2O補足25μL；94℃預變性5min；94℃變性45s，36℃退火40s，72℃延伸1min，共30個循環；，最后72℃延伸10min，擴增結果穩定。

3 討論

影響RAPD反應的因素很多，任何一種因子設置不當都會影響整個擴增反應。RAPD反應，對DNA純度要求不高，但模板DNA濃度是影響RAPD擴增產物產率與特異性的一個重要因子。模板過量，造成引物相對缺乏而抑制擴增反應，使生成的條帶減少而出現不同的指紋圖。模板濃度過低，不能發生有效的擴增反應或者擴增后圖譜變異較大［16］。在PCR反應中，Mg2＋是TaqDNA聚合酶的激活劑，太低或太高都將影響酶的活性，其濃度還影響引物與模扳的解鏈與退火。一般需將 Mg2＋濃度控制在大于2μmol/L，低于此濃度會導致擴增條帶的穩定性及可靠性。引物在RAPD反應中是一關鍵因素。但RAPD擴增反應對引物也沒有嚴格的種屬界限，引物的設計除長度較短，為10個堿基左右外，其余規則與一般PCR相同。

dNTPs是PCR反應的底物，其濃度高低會影響到擴增產物的多少。濃度過低，在反應過程中dNTPs被過早消耗完后，會減少擴增產物的產量［17］；dNTPs濃度過高時，則會與TaqDNA聚合酶爭奪 Mg2＋，使Taq酶活性降低，不能充分發揮聚合作用而導致擴增失敗。

此外，變性時間是影響RAPD反應最重要的因子之一。如變性時間過短，DNA模板將不能充分解鏈，引物就不能完全結合到DNA模板上，從而導致擴增條帶較少；如變性時間過長，會影響Taq酶活力，降低擴增效率，導致擴增結果的不穩定和效率低等問題［18］。故應參考相關反應體系，在保證條帶清晰、穩定的條件下，選擇合適的變性時間，保證Taq酶的活性，達到擴增的最佳效果。退火溫度對PCR反應的特異性具有非常重要的作用。在RAPD反應中，引物只有10bp，40℃以上的退火溫度會影響引物與模板的結合穩定性，所以一般都低于40℃。

開頭十二個小節的連線都沒有超過一個小節的長度，但是從第13至16小節，卻用了長達四小節的連線，并且還有“漸強”的標記。貝多芬在這里暗示了一種更為歌唱性的句法。

研究對影響裸果木RAPD擴增體系的一些因子進行了實驗和分析，建立了一個比較穩定的RAPD擴增體系。但是要獲得重復性較好的結果，除了采用建立起來的最佳體系外，還應將多個裸果木群體同時分析，將特異的標記轉化成SCAR來進一步提高其穩定性，以用于橫向比較，為資源的保護與利用提供依據。由于對裸果木基因組DNA進行RAPD分析的報道極少，為了尋找適合此次實驗的最佳RAPD反應體系，采用單因子梯度設計分別對反應體系中的模板DNA濃度、引物濃度、Mg2＋濃度、dNTPs濃度、變形時間及退火溫度進行了梯度實驗和反應條件的優化。通過優化，獲得了穩定性較好，重復性比較高的擴增產物，建立了一套適合裸果木的RAPD反應體系，為進一步對裸果木基因組進行RAPD多態性分析，展開裸果木的遺傳多樣性研究和種質資源保護提供了有價值的科學參考。

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