衛(wèi)星搭載對羊草種子萌發(fā)及細胞學效應的研究

潘多鋒，張月學，申忠寶，王建麗，張瑞博，李道明，高 超，邸桂俐，劉錄祥，鐘 鵬

（1.黑龍江省農業(yè)科學院 草業(yè)研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；2.中國農業(yè)科學院作物科學研究所/國家農作物基因資源與基因改良重大科學工程，北京 100081；3.黑龍江省農業(yè)科學院大豆研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

太空誘變育種是利用各類飛行器（衛(wèi)星、飛船或航天飛機）將農作物種子及其他生物體樣品帶上外太空［1］，在空間特殊環(huán)境（宇宙射線、高真空、微重力等）作用下產生變異，獲得生物新品種的育種新技術［2，3］，被廣泛應用于植物育種［4－8］。近年來，許多研究者將這一新的育種方法應用于牧草研究。經衛(wèi)星搭載的紅豆草（Onobrychis viciaefolia）、苜蓿（Medicago sativa、早熟禾（Poa pratensi）、冰草（Agropyron cristatum）、新麥草（Psathyrostachys juncea）等牧草品種，經試驗發(fā)現(xiàn)有花期和生長期延長、抗病性增強、抗鹽性和抗旱性提高、早熟、植株矮化、葉片數增加等豐富的突變類型［9－14］，為優(yōu)質、高產和多抗牧草新品種的選育提供了豐富的遺傳材料。

羊草（Leymus Chinensis）又稱堿草，為多年生根莖型牧草，被譽為“禾本科牧草之王”，是現(xiàn)代牧草產業(yè)技術體系重點發(fā)展的牧草之一。羊草在自然界中以無性繁殖為主，有性繁殖為輔，其本身固有的“三低”問題（成穗率低、結實率低、發(fā)芽率低），嚴重制約了羊草種質資源的創(chuàng)新。因此，羊草新種質資源的開發(fā)與利用已成為目前研究的熱點問題。我國選育出的羊草新品種很少，大多采用野生馴化選育，“三低”問題仍然存在［15，16］。目前，空間誘變技術在羊草育種中的應用研究很少有相關報道。“實踐八號”衛(wèi)星搭載羊草種子后對其萌發(fā)、細胞有絲分裂指數、根尖細胞核畸變及染色體畸變等進行了研究，探討衛(wèi)星搭載后羊草種子的萌發(fā)特性及細胞生物學效應，為我國羊草空間誘變育種研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

“實踐八號”衛(wèi)星搭載的羊草為野生東北羊草，種子由黑龍江省農業(yè)科學院草業(yè)研究所提供。

1.2 搭載處理

“實踐八號”衛(wèi)星是我國第1顆專用育種衛(wèi)星，2006年9月9日5：00在酒泉衛(wèi)星發(fā)射中心由長征二號丙運載火箭發(fā)射升空。衛(wèi)星運行的近地點高度為187km，遠地點高度463km，軌道傾角63°，在軌運行15d，返回艙于9月24日10：43在四川遂寧成功返回。衛(wèi)星運行期間回收艙內溫度在7.21～20.72℃。

將羊草干種子3 000粒用白色棉布袋包裝注明，搭載于“實踐八號”衛(wèi)星，為太空誘變（SP），相同數量的同批種子作為對照（ck）。

1.3 發(fā)芽試驗

發(fā)芽試驗采用濾紙培養(yǎng)皿發(fā)芽法，將處理和對照種子放在鋪有單層濾紙9cm玻璃培養(yǎng)皿內，3次重復，每重復50粒飽滿種子。發(fā)芽溫度16℃/28℃，12 h黑暗/12h光照。從第1粒種子萌發(fā)開始，每天觀察、統(tǒng)計1次發(fā)芽數直至萌發(fā)結束。初計數時間為第6d，末次計數時間為20d。試驗結束時在每個重復中隨機取10個幼苗，用游標卡尺測量幼苗長度。

（1）發(fā)芽率＝發(fā)芽種子數/種子總數×100%

（2）發(fā)芽指數GI＝∑（Gi/Di）

式中：Gi為第i天的發(fā)芽率，Di為天數。

（3）活力指數DI＝GI×Ss式中：Ss為幼苗長度［17］。

1.4 細胞學觀察

1.4.1 根尖染色體制片 將對照與搭載后的干種子50粒消毒清洗后分別放入培養(yǎng)皿中，置于25℃溫箱中培養(yǎng)至露白，4℃低溫處理48h，然后置25℃下繼續(xù)培養(yǎng)，根尖長至1.5cm剪下吸干，放在冰水混合物中冷處理20～22h，用卡諾氏固定液（無水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）固定22h。將材料從固定液中取出，用溫水把根尖水洗2～3次；用預熱1mol/L鹽酸在60℃水浴下解離6min；取出后再用溫水沖洗2～3次，并用濾紙吸干，加入謝夫試劑染色3h，然后將根尖放入醋酸洋紅中復染48h，進行染色體制片（對照和搭載處理各15張）。染色體觀察、取材時間非常關鍵，應標明根尖的具體取材時間（根尖的具體取材時間為根尖長至1.0～1.5cm時取材，減數分裂和具體時間有關，未作減數分裂方面的試驗）。

1.4.2 鏡檢 隨機抽取14個染色體制片進行細胞學統(tǒng)計，在20倍鏡下觀察，每個染色體制片更換4～5個視野，每張染色體制片統(tǒng)計280個細胞，Leica 4000 MB高倍顯微鏡下拍照。觀察、統(tǒng)計細胞總數、分裂細胞數、正常分裂細胞數、微核數、染色體斷片數、染色體粘連數、游離染色體數、染色體橋數、落后染色體數以及染色體的其他畸變數目，統(tǒng)計并計算：

（1）細胞分裂指數（%）＝（分裂細胞數/觀察細胞總數）×100

（2）染色體畸變率（%）＝（染色體總畸變數/觀察細胞總數）×100

（3）核畸變率（%）＝（核總畸變數/觀察細胞總數）×100

2 結果與分析

2.1 太空誘變對羊草種子萌發(fā)的影響

太空誘變處理羊草種子的發(fā)芽率21.44%，對照為26.50%；處理發(fā)芽指數為23.10，對照為25.06；處理的種子活力指數是118.99，對照為130.19。方差分析結果和對照間的發(fā)芽率、發(fā)芽指數和活力指數處理均無差異（P＞0.05）。結果表明太空誘變對羊草種子萌發(fā)的影響不大（表1）。

表1 太空誘變下羊草種子的萌發(fā)Table 1 Effect of seed germination of Leymus chinensis on embarked by space flight

2.2 太空誘變下羊草根尖細胞有絲分裂和核畸變

太空誘變處理對羊草種子根尖細胞有絲分裂產生一定的影響（表2）。太空誘變根尖細胞有絲分裂指數為8.97%，對照為7.19%，太空誘變處理比對照增加24.17%，說明太空誘變可以促進羊草種子根尖細胞有絲分裂。

表2 太空誘變對羊草根尖細胞有絲分裂指數及核畸變的影響Table 2 Effect of the mitotic index and nuclear aberrations of root tip cells of Leymus chinensis on embarked by space flight

與對照相比，太空誘變后羊草根尖細胞在有絲分裂間期發(fā)生核畸變。太空誘變根尖細胞在有絲分裂間期出現(xiàn)了單微核和雙微核2種類型核畸變，核總畸變率為1.57%（表2）。其中，單微核率為0.93%，是主要的變異類型，占核總畸變的59.24%，雙微核畸變率為0.64%，占核總畸變的40.76%。

2.3 太空誘變對羊草根尖染色體畸變的影響

對照根尖染色體無畸變發(fā)生，太空誘變后則產生變異。太空誘變后羊草根尖細胞染色體在分裂中期出現(xiàn)染色體斷片、染色體粘連等畸變類型；在分裂末期出現(xiàn)染色體單橋、雙橋、落后染色體、游離染色體等畸變類型，染色體總畸變率為3.68%。其中，染色體斷片所占比例最大，占總畸變類型的32.34%，其次為染色體粘連（21.78%）和染色體單橋（16.85%），染色體雙橋變異最少，占總變異的9.24%（表3，圖1）。

表3 太空誘變對羊草根尖細胞染色體畸變的效應Table 3 Chromosome aberrations of root tip cells in Leymus chinensis embarked by space flight

圖1 “實踐八號”衛(wèi)星搭載后羊草根尖染色體的畸變類型Fig.1 Chromosome aberrations of Leymus chinensis embarked by space flight

3 討論和結論

3.1 太空誘變對羊草種子萌發(fā)的影響

許云遠等［18，19］的研究表明，太空誘變對草地早熟禾、紅豆草、冰草和苜蓿等牧草種子的發(fā)芽率無顯著影響或影響不明顯，杜周和等［12］發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星搭載后高丹草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均受到不良影響，發(fā)芽能力降低。本試驗結果顯示，太空誘變處理對羊草種子萌發(fā)特性影響不大，雖然種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數和活力指數均低于對照，但差異不顯著（P＞0.05）。羊草的休眠類型屬萌發(fā)抑制物引起的生理性休眠，抑制物主要是脫落酸（ABA），主要抑制部位為胚乳，羊草種子的休眠是萌發(fā)抑制物與萌發(fā)促進物（多種激素，如玉米素、赤霉素、生長素等）綜合作用的結果［20］。太空誘變后造成羊草種子萌發(fā)能力降低的原因有待于進一步的研究。

3.2 太空誘變對羊草細胞有絲分裂的影響

太空誘變是空間輻射、微重力和高真空等因素綜合作用的結果，在誘因上與地面單一的理化誘變因素完全不同，是一個很復雜的過程。已有的研究表明，衛(wèi)星搭載對當代種子根尖細胞有絲分裂有促進（分裂指數增加）和抑制（分裂指數減少）2種影響，具體效應因品種而異［21，22］。試驗中太空誘變明顯促進了根尖細胞的有絲分裂活動，有絲分裂指數高于對照。細胞分裂指數體現(xiàn)了細胞分裂能力，該能力是否會影響幼苗及后期生長需進一步研究。

3.3 太空誘變對羊草細胞核及染色體畸變的影響

細胞微核是由染色體受損后形成的斷片或紡錘體受損丟失的整條染色體形成，具有可遺傳性，是衡量染色體誘變損傷的可靠指標［23］。研究表明，經太空誘變后羊草根尖細胞出現(xiàn)了微核和雙微核2種核畸變類型，說明衛(wèi)星搭載使羊草細胞發(fā)生了變異，這種變異可作為羊草空間誘變遺傳育種的重要理論依據。

染色體是遺傳信息的載體，染色體變異必然導致遺傳變異的發(fā)生，是生物遺傳變異的重要來源，以染色體畸變率作為檢測誘變源的生物效應和遺傳效應的指標是比較直接［24］。羊草經空間搭載后其根尖細胞染色體出現(xiàn)染色體單橋、斷片、雙橋、游離染色體、落后染色體、染色體斷片、染色體粘連等多種畸變類型。針對染色體變異類型能否在后代植株中表達、如何表達以及是否出現(xiàn)優(yōu)異突變體等將會成為今后研究的重點。

試驗結果表明，太空誘變處理對羊草種子的萌發(fā)能力影響不大，但能夠促進羊草種子根尖細胞的有絲分裂、誘導細胞核和染色體發(fā)生變異。

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