口腔扁平苔蘚中抗凋亡蛋白Bcl－2的表達研究

滿 一 阿達萊提·阿合買提江 張穎奇

1 中國石油天然氣集團公司中心醫院口腔科，河北省廊坊市 065000； 2 新疆醫科大學第一附屬醫院口腔頜面外科

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種常見的病因不明的非感染性黏膜病。病理表現為真皮淺層存在以CD4＋和CD8＋T細胞為主的免疫細胞過度浸潤，表明局部淋巴細胞增殖和凋亡出現障礙，明顯的病理特點基底細胞液化變性；上皮棘層、顆粒層楔形增厚。本研究采用免疫組化法，通過觀察凋亡相關蛋白Bcl－2生物學行為對免疫細胞與上皮細胞凋亡的影響，初步探討扁平苔蘚發病機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院保存的石蠟切片共50例，其中正常口腔黏膜25例（對照組），扁平苔蘚25例（OLP組），其中網紋型15例，糜爛型10例。所有檢材診斷和組織學分類均依據WHO標準，由同一名經驗豐富的病理學專家完成。

1.2 試劑 所有試劑均購自福州邁新生物技術有限公司。Bcl－2為即用型鼠抗人單克隆抗體，SP復合物MaxVisionTM為快捷即用型，通過聚合物技術把過氧化物酶與抗鼠和抗兔IgG分子結合在多聚物上形成多聚物分子，使得酶分子與二抗直接結合形成的多聚物分子高度敏感性染色強度增大，避免非特異性背景染色。DAB顯色試劑盒為鏈酶卵－辣根過氧化物酶（HPR）系統免疫組化染色Elivison，適用于SP法。

1.3 實驗方法 采用免疫組化鏈霉素抗生素－過氧化物酶免疫組織化學染色方法（streptavidin－peroxi－dase，SP）檢測細胞凋亡與增值狀況。所有組織切片經10%甲醛固定、常規脫蠟、透明、浸蠟、石蠟包埋。5μm連續切片，固定于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，常規組織切片脫蠟入水；微波加熱10min暴露抗原；過氧化物酶溶液阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS水沖洗，鼠抗人即用型Bcl－2抗體37℃孵育60min，加入SP復合物 HRP－MarVisionTM，30℃孵育60min；加入SP復合物 HPR，4℃過夜；DAB緩沖液、DAB底物、DAB色原順序加入、混勻成DAB顯色液滴定組織切片，室溫下顯色10min，顯色后蘇木素復染，常規脫水，二甲苯透明，封片。以PBS代替一抗為陰性對照，Bcl－2以邁新公司提供的淋巴瘤陽性片為Bcl－2做對照。

1.4 結果判定 采用HM2A8－2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統，每例每張切片各隨機選取5個不重復、不重疊200和400倍高清視野，細胞質和細胞核染成棕色或棕紅色顆粒或彌漫成片狀為Bcl－2的陽性表達。計數切片中1 000個上皮基底細胞中的陽性細胞數及高倍視野下（×400）的Bcl－2陽性染色細胞數。參照 Hueber［1］標準，將 Bcl－2表達定級為：未見陽性細胞著色為陰性（－）；陽性細胞數＜10%為（＋）；11%～25%為（＋＋）；26%～50%為（＋＋＋）；＞50%為（＋＋＋＋）。

1.5 統計學分析 病變組織與對照組中陽性表達率以及各種臨床指標中的表達率的差異采用χ2檢驗；Bcl－2陽性表達率的差異采用Fisher精確概率法單因素相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義，統計學分析采用SPSS統計軟件包11.5版本處理。

2 結果

實驗結果統計顯示：正常黏膜內上皮層Bcl－2蛋白陽性細胞表達率16%，主要分布在上皮基底細胞及棘層，角化層Bcl－2蛋白弱表達，點狀、均勻分布，未見貫穿上皮全層的陽性染色，固有層罕見淋巴細胞，Bcl－2蛋白陽性率24%，見圖1、2。扁平苔蘚上皮細胞中Bcl－2陽性細胞主要分布于棘層、顆粒層，部分貫穿上皮全層，陽性細胞表達率48%，見圖3、4。真皮淺層密集的高強度Bcl－2陽性表達淋巴細胞，陽性檢出率72%，高強度陽性表達程度增加，各期扁平苔蘚與正常口腔黏膜比較，差異顯著，見表1。扁平苔蘚各組內自身比較，固有層與上皮層Bcl－2陽性染色率無差異，病變組各期與對照組比較差異顯著，見表1、2。與固有層中的淋巴細胞染色相比，扁平苔蘚上皮細胞層Bcl－2蛋白的分布和密度要弱，見圖5、6。另外，Bcl－2陽淋巴細胞分布呈現規律性，主要表現出兩種分布形式：巢形分布，以數個密集排列的Bcl－2強陽性淋巴細胞為中央區域，周圍細胞明顯聚集，巢形團重疊擠壓，沿真皮乳突層帶狀排列；其二無明顯聚集趨勢的散在分布，但染色強度未降低。

表1 Bcl－2蛋白在口腔正常黏膜、扁平苔蘚病損各組織中的表達

表2 Bcl－2在對照組與OLP組織中表達率的比較（）

表2 Bcl－2在對照組與OLP組織中表達率的比較（）

注：對照組內▲為t＝2.971，P＞0.05，OLP組與對照組比較★為t＝5.475，P＜0.05。

分組 n Bcl－2陽性表達上皮層 固有層對照組 25 14.41±0.01 27.44±0.13▲OLP組 25 51.95±0.25 67.05±0.42★

圖1 Bcl－2在正常口腔黏膜上皮中弱表達

圖2 Bcl－2在正常口腔黏膜 上皮中弱表達

圖3 網紋型OLP的Bcl－2表達，淋巴細胞浸潤帶斷裂，基底較完整

圖4 糜爛型OLP的Bcl－2 表達，基底液化，棘 層增厚

圖5 扁平苔蘚皮損中淋巴細胞巢型分布

圖6 扁平苔蘚皮Bcl－2高 表達，棘層增厚

3 討論

本研究系統地觀察了健康口腔黏膜與OLP各期病損區細胞凋亡狀況，顯示包括正常黏膜在內的所有上皮細胞均有抑制凋亡蛋白Bcl－2陽性表達，是一種普遍現象，這與國內外文獻報道符合［2，3］。正常口腔黏膜中，Bcl－2陽性細胞主要分布在上皮基底細胞及棘層，這符合細胞分化周期過程。Bcl－2正常表達可保證角質形成細胞增殖分裂能力，并向上移行分化成熟至表面衰老死亡，完成連續的細胞周期。Bcl－2敲除（kick out）實驗證實［4］，生理狀況下 Bcl－2正常分泌是細胞周期連續運轉及細胞數量相對平衡的需要，有利于順利通過G2/M細胞周期調控點，觸發有絲分裂，Bcl－2表達缺乏則休眠期細胞增多，正常發育細胞將暫時或永久退出細胞周期。當細胞周期完成即將通過凋亡而發生克隆消失時，Bcl－2的表達則應下調［5］，維持口腔黏膜上皮的分層結構并保持細胞數目的動態平衡。而Bcl－2蛋白過表達，不成熟細胞存活增加，細胞壽命延長，數量積累。

實驗顯示與扁平苔蘚上皮層相比，真皮層淋巴細胞浸潤帶Bcl－2染色強度跳躍式增強，但分布并不連續均勻，存在局域性差異。巢形分布集中區域，淋巴細胞的Bcl－2特異性免疫反應活躍，對應的上方既可以出現表皮楔形增厚，又能觀察到明顯的基底細胞液化，楔形增厚之間的界面大多破壞明顯；同時也觀察到基底層趨于較為完整，棘層也并無明顯增厚，與之對應的下方真皮層Bcl－2陽性細胞連續性發生斷裂，只有點狀、散在Bcl－2陽性細胞浸潤，上皮層變性與Bcl－2陽性表達的淋巴細胞強度似有明確的上下對應關系。統計學也顯示，OLP病損區與照組固有層淋巴細胞Bcl－2陽性表達率差異有顯著性。對此筆者推測：（1）免疫細胞生物活性的增強與抑凋亡蛋白 Bcl－2 過 表 達 有 關 系 。 相 關 研 究 表 明［6］，Bcl－2與CD4＋、CD8＋細胞及存在于生發中心的T細胞有高度的親和力，Bcl－2在T淋巴細胞發育成熟期活性增強，Bcl－2過表達致自身反應性T淋巴細胞逃避了胸腺的陰性選擇而持續存在。（2）上皮基底層的液化變性并不是內在因素所致，而是Bcl－2活化后的淋巴細胞攻擊和誘導，這種方式的損傷主要是Tc細胞、NK細胞通過釋放穿孔素致角質形成細胞凋亡，液化變性。研究表明淋巴細胞的活化又可增加bcl－2的轉錄，延遲成熟淋巴細胞死亡，淋巴細胞數量絕對值增加，特異性細胞毒性T細胞的活力增強；激發淋巴因子釋放；（3）OLP中淋巴細胞的聚集可能受到Bcl－2激活趨化。相關研究顯示［7］，被淋巴細胞破壞后的上皮細胞又可以產生RANTES（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）、IL－6等炎性因子，而 Bcl－2誘導活化后的T淋巴細胞受體對RANTES、IL－6敏感性增強，游走能力增強，穿越血管內皮持續性歸巢，吸引更多的淋巴細胞到皮損區。

除真皮層過度的淋巴細胞浸潤外，在組織病理上OLP屬于苔蘚樣界面皮炎，上皮增殖也是其特點。與正常口腔上皮比較，本實驗顯示扁平苔蘚顆粒層灶性楔形增厚，棘層不規則增厚，角化不全，表皮突延長呈鋸齒狀。Bcl－2陽性表達主要位于扁平苔蘚皮損區棘層，且陽性表達率高于正常人組，非糜爛型上皮表達率達最高，而在糜爛型則有所下降。據此推測Bcl－2的過表達抑制棘層細胞凋亡，致使棘層增厚，使角朊細胞壽命延長，導致棘層和顆粒層增厚。MaCall和Smith等人在對正常皮膚角質細胞的觀察中發現多位于角化下層，認為正常角質形成細胞的凋亡實際上就是細胞分化的過程［8］，Bcl－2的激活干擾了細胞正常分化，上皮細胞分裂周期延長，細胞個體壽命延長，“凋亡細胞”的繼續生存影響細胞數量增加。

值得注意的是，本實驗也觀察到有28%（25例中7例）病例可見較明顯的“表達錯位”，即Bcl－2表達與表皮層的增厚、基底層液化變性的位置關系并不固定或呈明確的上下對應關系。表現為表皮層楔形增厚而Bcl－2表達強度降低，Bcl－2表達增強而并無明顯的棘層增厚；另外以真皮淺層Bcl－2陽性表達的淋巴細胞浸潤為主，在其上方即可以出現灶狀基底細胞液化變性，又能觀察到基底層趨于完整。對此筆者推測Bcl－2的干預可能并不是OLP上皮改變的唯一因素，可能還有其他因素參與了基底細胞液化寄表皮層局灶性增厚的發生，并在OLP的發展中起到了相當重要的作用。

造成Bcl－2蛋白表達在水平重度異常增生階段有所下降可能的因素是：（1）機體為抑制過度生長的細胞群體，新生細胞啟動了某種細胞自穩定機制，試圖促進增殖細胞的凋亡，維持細胞數目的穩定；（2）重度異常增生階段細胞增殖能力爆發式提高，大量病變細胞的堆積，導致局部缺血、缺氧、免疫細胞釋放免疫因子、細胞毒性T細胞的攻擊，而加快了老化的細胞凋亡［9］；（3）實驗樣本數量偏少或其他因素影響了統計結果的精確性。

總之，扁平苔蘚的病變發展過程中，口腔黏膜上皮組織細胞與免疫細胞的凋亡狀況發生了改變，扁平苔蘚的發病機制與Bcl－2在特定部位的過度表達有關，但不排除其他因素的參與。

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