HSP70在胃癌中的表達及意義

尚進才 劉偉新 焦成斌

佳木斯大學附屬第一醫院普外科，黑龍江省佳木斯市 154002

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是細胞受到刺激后產生的蛋白質，它高度保守。實驗證實HSP在某些腫瘤組織中的表達與在正常組織中的表達不同［1，2］，如在卵巢癌中的表達與其臨床病理分期和術后生存有關［3］，證實其是存在于腫瘤與正常組織間的一種差異蛋白［4］。本實驗采用免疫組化法、組織芯片技術及RT－PCR法研究HSP70在胃癌、癌旁組織、胃炎組織和正常組織中的表達，并研究其與臨床資料間的關系，為胃癌的發展和預后提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 組織芯片標本為佳木斯大學附屬第一醫院手術切除、經病理診斷證實為胃腺癌組織、距胃癌組織邊緣1.5cm處的組織、距胃癌組織邊緣5cm以上的正常胃黏膜組織及胃炎組織標本60例，用組織芯片制作儀細針打孔，制作組織芯片。在術前這些患者均未接受任何抗癌治療，男43例，女17例。本組患者平均年齡（60±12）歲（中位年齡60.5歲，33～81歲）。RT－PCR組織標本也來自該院病理科提供的10例胃癌患者，及對應的癌旁組織、胃炎組織和正常胃黏膜組織。根據Lauen分類法（1965年）將腫瘤分類：60例中，腸型20例，彌漫型40例。按照腫瘤的分化分三類：高分化4例，中分化10例，低分化46例。根據國際抗癌聯盟（UICC）1987年公布的胃癌TNM分期法將腫瘤分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期19例，Ⅲ期20例，Ⅳ期10例。17例陽性患者淋巴結陰性，43例陽性患者淋巴結陽性（N127例，N216例）。在檢查的60例中有3例遠處轉移。所有標本經10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4μm厚切片。

1.2 方法

1.2.1 制作組織芯片：HE染色切片，行病理診斷，標記病變組織范圍。新鮮腫瘤組織經石蠟處理后，按照實驗目的設計組織芯片陣列的組織類型和排列方式；在組織數據庫中選擇合適的組織病例編號；按照組織病例編號從組織庫中取出組織蠟塊和對應的HE染色切片；用組織包埋機制備合適的空白受體蠟塊；用組織陣列儀按照陣列設計抽提病理蠟塊組織芯并有規律地排列在空白受體蠟塊上；將組織陣列塊置于52℃的恒溫烤箱中進行加熱融合，使組織芯與受體蠟塊緊密相連；用直徑1mm的打孔針，在全自動組織切片機上以20μm/min的進刀速度對組織陣列塊進行蠟塊修整，直至80%的組織芯完全暴露。在全自動組織切片機上以4μm/min的進刀速度對組織陣列塊進行切片；將切片裱附于防脫片處理的載玻片上；將陣列切片置于60℃恒溫烤箱中加熱16h；按編號，每隔10張組織芯片抽取一張進行HE染色；對抽檢組織芯片中的每一個組織樣本進行復診質檢；組織芯片實驗白片保存于切片盒中，置于5℃冰箱保存；對使用過的病理組織蠟塊進行封臘，并將其和對應的HE染色切片歸位放回蠟塊柜和切片盒中。

1.2.2 免疫組織化學染色：ElivisionTMplus試劑盒將多個抗鼠和抗兔IgG分子與辣根過氧化物酶聚合，所形成的聚合物直接與一抗結合，從而放大了抗原抗體結合的信號。其染色步驟如下：（1）芯片脫蠟和水化。（2）根據每一種抗體的要求，對組織抗原進行檸檬酸修復液（pH值6.0）熱修復20min。（3）每張切片加1滴或50μL 3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶。PBS沖洗3×3’。（4）甩去PBS液，每張切片加1滴或50μL的第一抗體，室溫下孵育60min或4℃過夜。（5）PBS沖洗3×5’。（6）甩去PBS液，每張切片加1滴或50μL聚合物增強劑（試劑A），室溫下孵育20min。（7）PBS沖洗3×3’。（8）甩去PBS液，每張切片加1滴或50μL酶標抗鼠/兔聚合物（試劑B），室溫下孵育30min。（9）PBS沖洗3×3’。（10）甩去PBS液，每張切片加2滴或100μL新鮮配置的DAB顯色液，顯微鏡下觀察3～10min，陽性顯色為棕色或紅色。（11）蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，PBS沖洗返藍。（12）用DAB顯色，切片經過梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封片。染色結果判斷：（1）陽性染色細胞是通過在每種條件下都由兩個獨立的觀察者在不知全部觀察者所認同的臨床數據的情況下所獲得的。（2）陽性結果判定：免疫組化的陽性表達均為各自染色條件下結構完整、定位明確、染色對比清晰，以細胞漿出現棕黃色染色或伴有胞核棕黃色顆粒的細胞。（3）切片在200倍鏡下觀察5～10個視野，每個視野計數100～200個腫瘤細胞，共計1 000個細胞，根據陽性細胞表達率分為：陰性為無著色細胞、背景同陰性對照或者陽性細胞率＜5%；陽性為細胞呈棕黃色和/或陽性細胞率為≥6%。

1.2.3 RT－PCR 檢測：用 Trizol法提取組織總RNA，用紫外分光光度計在260和280nm處測定吸光度D值，計算RNA含量和純度，按公式c＝（D260/D280）×稀釋倍數/25計算 RNA 濃度。反轉錄總反應體積為20μL，包括 M－MLV5×reaction buffer 4μL、dNTP（10mmol/L）2μL、RNase inhibitor 0.5μL和 M－MLV RT 1μL，加水至20μL反應體系；反應條件：37℃60min，70℃加熱10min滅活后冰上冷卻；將獲得的cDNA第一鏈產物置于－20℃保存，待行PCR擴增處理。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成：HSP70（482bp）上游引物為5’－TGTTCGGAGTGGTTAGG－3’下游引 物 為 5’－TCTCATCGGATTTGGCAG－3’；βactin（182bp）上游引物為5’－GGAACTCGTGCGTGACATT－3’下游引物為5’－GGACGGAAGGCTGGAAGAGTG－3’。反應體系（20μL）包括 Taq酶0.2μL，dNTP（10mmol/L）0.2μL，上、下游引物各0.2μL，cDNA 0.1μL，10×Taq buffer 2μL，加ddH2O補充至反應體系達20μL。PCR反應條件：第一步，95℃預變性5min；第二步，95℃30s、55℃40s、72℃1min，共30個循環。4℃保存擴增產物，行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在紫外燈下進行觀察，凝膠分析系統拍照。結果判定：目的基因相對表達水平＝（目的基因灰度值－背景灰度值）/（內參基因灰度值－背景灰度值）。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件對數據進行處理，各樣本資料差異的統計學分析采用χ2檢驗、秩和檢驗及Fisher確切概率法。

2 結果

2.1 組織芯片及免疫組織化學檢測結果 組織芯片由60（病例數）×4（胃癌組織、癌旁組織、胃炎組織及正常組織各取一點）組成。檢測結果顯示，HSP70主要在胃癌組織的細胞質中表達，細胞核及細胞膜上有少量表達；正常胃組織細胞中的表達水平較低（圖1）。HSP70在胃癌組織的表達陽性率分別為75%（表1）。HSP70在胃癌中高表達，明顯高于癌旁組織（P＜0.01）、胃炎組織（P＜0.01）和正常組織（P＜0.01）。

胃癌組織中HSP70的表達與患者年齡、性別、腫瘤組織類型和浸潤胃壁深度無關（P＞0.05），與腫瘤分化程度、遠處轉移和臨床病理分期具有相關性（P＜0.05），詳見表2。

2.2 HSP70mRNA 的 RT－PCR 檢 測 結 果HSP70mRNA在胃癌組織、癌旁組織、胃炎組織及正常組織中的表達量分別為（2.78±0.02）、（1.89±0.02）、（1.57±0.03）、（0.98±0.03），胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織（P＜0.001）、胃炎組織（P＜0.001）和正常組織（P＜0.001）。

圖1 圖中依次是HSP70在胃癌低分化、中分化、高分化及正常胃組織中的表達

3 討論

組織芯片（tissue chip）又稱組織微列方陣（tissue microarray，TMA），是將許多不同個體組織標本以規則陣列方式排布于同一載玻片上，進行同一指標的原位組織學研究，極大地提高了檢測效率，目前已被廣泛應用于腫瘤學研究的各個領域［5，6］。

本研究的免疫組織化學結果提示，HSP70在胃癌組織中的表達水平上調，但低于文獻報道，可能與取材部位、檢測手段和結果判定標準的不同有關。其在癌旁組織、胃炎和正常組織中的表達無明顯差別，說明其與胃癌間具有的顯著差異性。本實驗采用RT－PCR技術對胃癌、癌旁組織、胃炎組織和正常胃黏膜組織中的mRNA表達進行了驗證，其在胃癌組織中的表達明顯升高與免疫組織化學結果一致，說明其轉錄和表達是一致的，說明其可能是通過參與胃癌細胞增殖的轉錄調控過程而在胃癌的發生中起某種作用。

總之，HSP70可能會成為一種腫瘤標志物。

［1］郭云鴻，田曉予，米建強，等.宮頸鱗癌組織中 HSP70和Bcl－2的表達及意義〔J〕.山東醫藥，2006，46（24）：11－12.

［2］栗軍香，張瑞英，魏紅，等.HSP70在急性白血病外周血細胞中的表達及臨床意義〔J〕.山東醫藥，2007，47（17）：44－45.

［3］李琳，陳惠禎，張廣平.熱休克蛋白27表達與卵巢癌預后〔J〕.腫瘤，2001，21（4）：288－290.

［4］羅治文，朱樑，謝笑娟，等.胃癌及癌旁組織定量比較蛋白質組學研究〔J〕.中國生物工程雜志，2007，27（7）：55－60.

［5］邵志濱.組織芯片技術及其在胃癌研究中的應用〔J〕.國際病理科學與臨床雜志，2007，27（3）：235－238.

［6］劉勇，路名芝.生物芯片技術及其在腫瘤研究中的應用〔J〕.江西醫學檢驗，2002，20（6）：376－378.