8-羥基脫氧鳥苷作為DNA氧化損傷標(biāo)志物在疾病診斷中的應(yīng)用*

高玉楠 ，楊 靖 ，宋沁馨 ，2，李 博 ，2，陳國華 ，丁 黎 ，2**

中國藥科大學(xué) 1藥物分析教研室；2藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點實驗室；3藥物化學(xué)教研室，南京 210009

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是機體內(nèi)一類活性含氧化合物的總稱，主要包括超氧陰離子基團、過氧化氫自由基、羥自由基等。ROS對多條細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有調(diào)節(jié)作用[1]。靜息條件下，機體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可以及時地清除多余自由基，維持機體的氧化還原平衡；但在疾病或某些外源性物質(zhì)刺激下，ROS快速釋放并在體內(nèi)過度蓄積，氧化應(yīng)激超出機體抗氧化能力，進而造成DNA的氧化損傷。而后者能夠產(chǎn)生大量嘌呤羥基化、嘧啶羥基化的堿基修飾產(chǎn)物。

在各種堿基修飾產(chǎn)物中，8-羥基脫氧鳥苷 （8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG， 結(jié)構(gòu)見圖 1）被公認(rèn)為是DNA氧化損傷的標(biāo)志物。其主要原因有兩點：（1）8-OHdG只通過DNA氧化損傷途徑形成，不是細(xì)胞更新產(chǎn)物，不會在系統(tǒng)循環(huán)中由dG氧化而成，它為代謝終產(chǎn)物，在體內(nèi)穩(wěn)定存在，其在體液中的水平不受飲食等因素影響；（2）8-OHdG可在通過堿基切除、核苷酸切除修復(fù)、錯配修復(fù)及阻止結(jié)合[2-3]等多種機體自我保護途徑的作用下從DNA鏈上切除，經(jīng)尿液排出體外，其半衰期為55 min[2-3]，較其他損傷產(chǎn)物長，方便檢測。

圖1 8-羥基脫氧鳥苷結(jié)構(gòu)式

在穩(wěn)態(tài)下，排泄出的8-OHdG的量等于氧化損傷新生成的8-OHdG的量，尿中8-OHdG的排泄量等同于DNA氧化損傷率，因此，尿中8-OHdG的排泄量可以反映整個機體平均的氧化損傷率，同時通過分析其在組織細(xì)胞核DNA及線粒體DNA中的含量，以反映體內(nèi)特定部位DNA氧化損傷和機體正常的修復(fù)作用。越來越多的研究證明，糖尿病（diabetes mellitus，DM）、癌癥、心血管疾病的發(fā)病和病情發(fā)展都與氧化損傷有著密切的關(guān)系，因此8-OHdG不僅是氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物，還是腫瘤和糖尿病的危險因子[4]，可用于氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的診斷。

1 8-OHdG與糖尿病的診斷

雖然糖尿病及其并發(fā)癥的具體發(fā)病機理仍未明確，但研究證實，氧化應(yīng)激與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[5]。

1.1 高血糖癥

在高血糖環(huán)境下許多組織都會產(chǎn)生大量ROS，這些ROS有可能參與胰島-β細(xì)胞機能異常和胰島素抵抗。因此，高血糖癥（hyperglycemia）患者尿液中8-OHdG排泄量明顯增加，8-OHdG排泄量與病患糖化血紅蛋白水平（HbA1c）呈正相關(guān)[6-7]。在對96例2型糖尿病患者的研究中，Nishikawa等發(fā)現(xiàn)HbA1c升高組比正常組尿中含8-OHdG高2.5倍[8]。但研究并未發(fā)現(xiàn)8-OHdG水平與其他糖尿病相關(guān)變量諸如血壓[8-9]、膽固醇[8-9]、甘油三酯有明確的關(guān)聯(lián)[1]。試驗還發(fā)現(xiàn)，加強胰島素治療組8-OHdG尿排泄量明顯低于常規(guī)胰島素治療組[8]。

1.2 糖尿病并發(fā)癥

8-OHdG的表達可以反映出氧化應(yīng)激參與2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)生。 與健康者相比，糖尿病患者體內(nèi)8-OHdG水平顯著增加。氧化應(yīng)激也參與包括腦病在內(nèi)的大血管和微血管急慢性并發(fā)癥的發(fā)生，無并發(fā)癥糖尿病患者與患有糖尿病并發(fā)癥患者體內(nèi)8-OHdG水平的差異也常見于各類報道。

1.2.1 糖尿病腎病 （Diabetic Nephropathy，DN）糖尿病腎病是最重要的糖尿病微血管并發(fā)癥之一。高血糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS參與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生，因此評價糖尿病患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)對于預(yù)測糖尿病腎病有重要意義[10]。

糖尿病腎病患者血清中8-OHdG水平顯著高于T2DM患者,而T2DM患者又明顯高于正常對照組[7，1]。氧化應(yīng)激的水平直接影響著糖尿病腎病微血管病變的程度，臨床糖尿病腎病患者24 h尿8-OHdG排泄量＞早期糖尿病腎病患者，大量蛋白尿組＞微量蛋白尿組，這與Xu等[9]以尿液中8-OHdG作為糖尿病腎病患者DNA氧化損傷研究的結(jié)果一致。提示8-OHdG表達明顯增高，是腎小球細(xì)胞蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激的指標(biāo)，可作為研究氧化應(yīng)激在糖尿病腎病發(fā)病機制中作用的檢測指標(biāo)之一[11]。聯(lián)合使用鈣通道抑制劑Azelnipidine和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑，可有效減少糖尿病性腎病患者8-OHdG 排泄量[12-13]。

1.2.2 糖尿病性視網(wǎng)膜病 （diabetic retinopathy，DR）Yoshihiro等[14]在研究糖尿病性視網(wǎng)膜病患者玻璃體中8-OHdG的濃度時發(fā)現(xiàn)，患者的濃度明顯高于對照組，而有無玻璃體血癥狀與玻璃體中8-OHdG濃度無顯著關(guān)聯(lián)，從而驗證玻璃體中8-OHdG濃度提高源于眼部組織ROS產(chǎn)物的增加，而非玻璃體充血由血液帶入。Pan等[15]得到8-OHdG在正常對照組、糖尿病組、糖尿病性視網(wǎng)膜病組濃度依次顯著增高的結(jié)果，從而得出糖尿病的發(fā)生由氧化應(yīng)激導(dǎo)致、氧化應(yīng)激是糖尿病性視網(wǎng)膜病變的重要危險因素的結(jié)論。

1.2.3 糖尿病心肌病 （Diabetic Cardiomyopathy，DC）通過研究101例糖尿病心肌病患者、73例T2DM患者和40例健康受試者的血清8-OHdG水平，發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病患者血清8-OHdG水平明顯高于糖尿病組和對照組，而且糖尿病心肌病患者心功能不全程度越重, 氧化應(yīng)激水平越高，8-OHdG水平越高，左心室中度和重度擴大組患者血清8-OHdG水平顯著高于輕度擴大組，左心室收縮功能不全+舒張功能不全組患者血清8-OHdG水平明顯高于單純舒張功能不全組[7]。

1.2.4 糖尿病冠狀動脈性疾病Nishikawa等[8]研究發(fā)現(xiàn)，8-OHdG尿排泄量的增加與冠狀動脈性心臟病風(fēng)險有顯著上升相關(guān)。35名伴有高血壓的T2DM患者在接受12個月的血管緊張素II受體阻斷劑（angiotensin II receptor blockers，ARB） 治療后，8-OHdG排泄量明顯降低[16]。在匹伐他汀治療12個月后，45名伴有高LDL膽固醇的T2MD患者8-OHdG尿排泄量明顯降低[17]。

2 8-OHdG與癌癥的診斷

眾所周知，氧化應(yīng)激在致癌作用中扮演著重要角色。未能及時修復(fù)的氧化損傷會顯著增加體內(nèi)突變率。越來越多的證據(jù)表明，惡性細(xì)胞有著高水平的氧化損傷，同時也在各種腫瘤中檢測到高水平的8-OHdG。近年來，在分子流行病學(xué)研究中，將氧化應(yīng)激機制與8-OHdG作為多種疾病（尤其是癌癥）的危險因子相結(jié)合的應(yīng)用研究有所增加[18]。針對不同類別的癌癥患者，檢測患者組織、體液中的8-OHdG水平，或作證預(yù)測癌癥患病風(fēng)險、預(yù)后、協(xié)助臨床治療。

2.1 肺癌

王云南等[19]發(fā)現(xiàn)8-OHdG主要分布在肺癌的癌灶部位，癌旁肺組織中的量明顯減少，肺癌組織、癌旁肺組織、肺良性病變和正常肺組織8-OHdG的陽性率依次降低。表明氧化損傷與細(xì)胞癌變在組織和細(xì)胞定位上具有一致性。另有結(jié)果顯示，尿液中8-OHdG含量取決于疾病的嚴(yán)重程度，尿液中8-OHdG含量由低到高依次為：轉(zhuǎn)移性肺癌、肺癌初期（原發(fā)性肺癌）、良性肺部疾病患者。肺癌患者中II～IV期肺癌患者尿液中8-OHdG含量低于I期肺癌患者。Sheng等[20]的研究還發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中8-OHdG水平較低的病人存活時間較長，8-OHdG水平高的病人的死亡的危險增加了3倍以上。Erhola等[21]證實，化療后非小細(xì)胞肺癌患者中無響應(yīng)或疾病惡化者尿液中8-OHdG/肌酐水平表達的DNA氧化損傷增加顯著，完全緩解或部分緩解者下降。在放療過程中，非小細(xì)胞肺癌患者8-OHdG/肌酐上升，放療結(jié)束后2個月，8-OHdG/肌酐恢復(fù)到放療前的基線水平。8-OHdG排放水平呈先增加后下降的趨勢。

2.2 卵巢癌

兩個獨立的研究小組[22-23]均發(fā)現(xiàn)上皮卵巢癌患者組織和血清中高水平的8-OHdG都可預(yù)示患者的低存活率，其中血清中8-OHdG濃度與I至II期患者死亡率關(guān)聯(lián)密切，這一結(jié)果與同時進行的傳統(tǒng)不良預(yù)后和血清組織學(xué)研究結(jié)果一致。Marjo等[24]還發(fā)現(xiàn)，良性和臨界性卵巢腫瘤氧化應(yīng)激水平相似，但其水平遠低于惡性腫瘤。

2.3 乳腺癌

Kuo等研究表明，乳腺癌患者尿8-OHdG水平為正常受試者的2.5倍[25]。在Sova等[26]的研究中，血清和腫瘤組織中8-OHdG水平高度一致，且它們的水平與乳腺癌惡性程度密切相關(guān)，尤其是乳腺導(dǎo)管癌。另有研究發(fā)現(xiàn)，8-OHdG免疫顯色呈陰性可作為乳腺癌病人死亡率的預(yù)后指標(biāo)，而8-OHdG血清水平負(fù)相關(guān)于乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.4 其他癌癥

8-OHdG水平與其它類型癌癥的發(fā)生發(fā)展也有明確的相關(guān)性。例如：Chang等[27]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸直腸癌患者血清中8-OHdG水平為對照組的4倍。Sato等[28]發(fā)現(xiàn)，血漿中8-OHdG水平明顯上升，可暗示有結(jié)腸直腸腺瘤和早期癌癥的患病風(fēng)險。在對表皮黑色素瘤的研究中，Murtas等[29]使用免疫組化法研究得出，核內(nèi)8-OHdG表達呈陽性的癌癥患者死亡風(fēng)險大大升高，核內(nèi)8-OHdG與其他傳統(tǒng)標(biāo)志物一起可以作為早期表皮黑色素瘤的預(yù)后因素。食道上皮細(xì)胞癌患者尿液中8-OHdG水平顯著高于對照組[30]。

3 8-OHdG與心血管疾病的診斷

ROS可以通過激活細(xì)胞分裂素活化蛋白酶和轉(zhuǎn)錄因子，來刺激心肌生長、介質(zhì)改造及細(xì)胞功能異常，從而對心臟結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生直接影響[31]。氧化損傷涉及到心血管疾病的發(fā)病和發(fā)展，大量文獻表明，8-OHdG可以單獨或與其他生理指標(biāo)一同反映心血管疾病病程、發(fā)病率和死亡率。例如：冠心病[32]、原發(fā)性高血壓[33]、慢性心力衰竭患者[34-35]血清中8-OHdG濃度高于健康受試者，其中，伴隨左心室肥大的高血壓患者即便接受了藥物治療，其尿8-OHdG水平仍然明顯較高于原發(fā)性高血壓[33]。患者體液中8-OHdG水平增加，其冠狀動脈狹窄程度增加[32]，心力衰竭病情加劇[34-35]。另有研究證實，8-OHdG水平與許多心臟功能參數(shù)有顯著關(guān)聯(lián)，其中與左心室射血分?jǐn)?shù)關(guān)系尤為密切，提示8-OHdG水平其可能為左心室機能異常及心室再造的臨床標(biāo)志物。這種關(guān)聯(lián)與腦鈉素（brain natriuretic peptide，BNP）一致，而BNP是目前評價慢性心衰的黃金標(biāo)準(zhǔn)[35]。因此，體液中8-OHdG水平可以有效地反映癥候和心臟機能，進而對慢性心衰嚴(yán)重性進行臨床診斷[35-37]。

4 8-OHdG的測定

目前常用定量方法測定8-OHdG，主要通過2種主要的分析途徑：一種是酶聯(lián)免疫吸附法 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[26，28]。ELISA因樣品處理過程簡便，但ELISA專屬性較差，如尿液中的尿素與8-OHdG就存在交叉反應(yīng)[38]，導(dǎo)致檢測值比真實值偏高，故得到數(shù)據(jù)需矯正，或選擇專屬性更強的檢測方法。

另一種為基于色譜聯(lián)用技術(shù)的檢測方法，如GC-MS[39]、HPLC-ECD[40]、LC-MS/MS[41-43]、CE-ECD[39，44]等。此類檢測方法的專屬性明顯優(yōu)于ELISA法，但樣品需經(jīng)過DNA提取水解、SPE純化，處理步驟較為復(fù)雜。

近年來LC-MS/MS及相關(guān)技術(shù)，如在線樣品處理技術(shù)與同位素稀釋的快速發(fā)展極大地提高了LC-MS/MS分析的靈敏度和可靠性[43-44]。因此，近年來LC-MS/MS技術(shù)逐漸成為定量測定體液中8-OHdG水平的主流解決方案。

5 小 結(jié)

8-OHdG能夠衡量細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，反映在病理狀態(tài)下細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，且經(jīng)代謝后在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)定存在，體液及相關(guān)組織器官的8-OHdG水平可以為評價發(fā)病風(fēng)險、疾病病程及治療效果提供更加直觀、有效的信息。因此，8-OHdG可能成為一種極有前途的生物標(biāo)志物并最終用于糖尿病、癌癥、心血管疾病等氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的病情診斷及治療評價。目前8-OHdG的臨床應(yīng)用尚在研究探索階段，受試者數(shù)量有限，缺乏合理的臨床設(shè)計，如受試者數(shù)量有限、未設(shè)計安慰劑對照等，且分析方法多采用專屬性不強的ELISA法測定，因此在具體應(yīng)用時應(yīng)謹(jǐn)慎分析對待這些研究結(jié)果，在未來的研究中需要采用更加專屬的測定方法，如LC-MS法，同時進行長期大規(guī)模研究并設(shè)置對照組或設(shè)計隨機臨床試驗來進一步確認(rèn)8-OHdG與各類具體疾病的發(fā)病、病程發(fā)展、預(yù)后之間的定量關(guān)系。

總之，8-OHdG作為生物標(biāo)志物對氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的診斷，相比于目前的方法在許多方面存在明顯優(yōu)勢，例如利用基于LC-MS技術(shù)定量地考察病患體內(nèi)8-OHdG水平及動態(tài)變化過程，而傳統(tǒng)免疫學(xué)方法僅能進行半定量或定性的判斷；并且測定8-OHdG所需樣品采集無創(chuàng)（如尿液中8-OHdG的測定），可大大提高患者順應(yīng)性，便于實時監(jiān)測和個體化治療。當(dāng)然，8-OHdG的水平差異變化也可以作為現(xiàn)有診斷方法的補充，以期進一步提高臨床診斷的準(zhǔn)確性和可靠性。

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