抗乳腺小葉增生合劑的質量標準研究

王亞洲，呂建偉（1.廣西醫科大學第四附屬醫院，廣西 柳州 545005；.廣西柳州市中醫院，廣西 柳州 545001）

抗乳腺小葉增生合劑為廣西醫科大學第四附屬醫院院內制劑，處方包括白芍、丹參、甘草、當歸、柴胡、郁金、夏枯草、元胡、生牡蠣等數味中藥，具有散瘀止血、消腫止痛、活血調經等功效[1]，臨床用于治療婦女乳腺小葉增生，療效明顯[2]，副作用小。原質量標準中只對丹參進行定性鑒別，規定相對密度≥1.02，并無含量測定內容。為進一步提高本制劑質量標準，更好地保證臨床療效，筆者參閱有關文獻[3，4]，對處方中的白芍、當歸和丹參進行了薄層色譜（TLC）鑒別，并用高效液相色譜（HPLC）法同時測定抗乳腺小葉增生合劑中芍藥苷、阿魏酸和甘草酸3種成分的含量。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp HPLC儀（日本Shimadzu公司）；752紫外分光光度計（南京麒麟分析儀器有限公司）；AB-L電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；MP511電子pH計（上海三信儀表廠）；B2500S超聲波清洗器（美國Branson公司）。

甘草、柴胡、元胡、生牡蠣藥材（柳州市百草堂中藥飲片廠，批號分別為110817、110922、110812、110825）；郁金藥材（國藥控股柳州有限公司，批號:20110914）；夏枯草藥材（柳州市神農飲片廠，批號:20110811）；芍藥苷、丹參酮ⅡA對照品和白芍、當歸、丹參對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110736-200630、110766-200518、 120905-201109、 120927-201014、 120923-200912）；阿魏酸、甘草酸標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為20110406、YY20101107，含量均≥98%）；抗乳腺小葉增生合劑（廣西醫科大學第四附屬醫院制劑室自制，批號:110715、110728、110810）；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 白芍的TLC鑒別

取本品10mL，加70%甲醇10mL，超聲（功率:120 W，頻率:40 kHz）處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2mL使溶解，作為供試品溶液；稱取白芍對照藥材粉末0.5 g，同法制成對照藥材溶液；按處方組成，取除白芍以外的其余藥材，按工藝要求制成缺白芍陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[1]試驗，吸取上述4種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果，供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。白芍的TLC見圖1。

2.2 當歸的TLC鑒別

取本品10mL，用乙醚振搖提取3次，每次10mL，合并乙醚提取液，揮干，殘渣加無水乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液；稱取當歸對照藥材粉末0.5 g，同法制成對照藥材溶液；按處方組成，取除當歸以外的其余藥材，按工藝要求制成缺當歸陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取阿魏酸標準品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為標準品溶液。照TLC法[1]試驗，吸取上述4種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品溶液色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。當歸的TLC見圖2。

圖1 白芍的TLC1～3.供試品；4.芍藥苷對照品；5.對照藥材；6.陰性對照Fig 1 TLC of Paeonia lactiflora1～3.test samples；4.paeoniflorin control；5.reference substance；6.negative control

圖2 當歸的TLC1～3.供試品；4.阿魏酸標準品；5.對照藥材；6.陰性對照Fig 2 TLC of Angelica sinensis1～3.test samples；4.ferulic acid standard；5.reference substance；6.negative control

2.3 丹參的TLC鑒別

取本品10mL，加乙醚10mL，振搖，放置1 h后取乙醚液，重復3次上述操作，合并乙醚液，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作為供試品溶液；稱取丹參對照藥材粉末0.5 g，同法制成對照藥材溶液；按處方組成，取除丹參以外的其余藥材，按工藝要求制成缺丹參陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取丹參酮ⅡA對照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[1]試驗，吸取上述4種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯（19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。丹參的TLC見圖3。

圖3 丹參的TLC1～3.供試品；4.丹參酮ⅡA對照品；5.對照藥材；6.陰性對照Fig 3 TLC of Salvia miltiorrhiza1～3.test samples；4.tanshinoneⅡAcontrol；5.reference substance；6.negative control

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Inertsil C8（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃（18∶80∶2）；檢測波長:300 nm；柱溫:30℃；流速:1.0mL·min－1；進樣量:20μL。在此色譜條件下，芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的色譜峰均能達到基線分離，其他成分對測定無干擾。芍藥苷保留時間約為10.1min，阿魏酸保留時間約為13.5min，甘草酸保留時間約為21.6min。色譜見圖4。

3.2 混合對照品溶液的制備

圖4 高效液相色譜圖A.供試品；B.陰性對照；C.混合對照品；1.芍藥苷；2.阿魏酸；3.甘草酸Fig 4 HPLC chromatogramsA.test sample；B.negative control；C.mixed control；1.paeoniflorin；2.ferulic acid；3.glycyrrhizic acid

稱取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的芍藥苷對照品和阿魏酸、甘草酸標準品各適量，精密稱定，置于同一棕色容量瓶中，加50%甲醇制成每1mL分別含芍藥苷1038.6μg、阿魏酸86.2μg和甘草酸1265.2μg的混合對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

精密量取抗乳腺小葉增生合劑10mL，置于100mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

3.4 陰性對照溶液的制備

按照處方組成，取除白芍、當歸和甘草以外的其余藥材，按工藝要求制成不含芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的陰性合劑，照“3.3”項下方法制成陰性對照溶液。

3.5 線性關系考察

取上述混合對照品溶液適量，用50%甲醇稀釋成6個濃度，即得芍藥苷濃度分別為 25.96、51.93、103.86、155.79、207.72、259.65μg·mL－1，阿魏酸濃度分別為2.15、4.31、8.62、12.93、17.24、21.55μg·mL－1，甘草酸濃度分別為31.63、63.26、126.52、189.78、253.04、316.3μg·mL－1的溶液，依次進樣，按上述色譜條件測定。再分別以各組分的檢測濃度（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的回歸方程分別為Y＝6037X+769（r＝0.9995，n＝6）、Y＝171526X－11067（r＝0.9998，n＝6）、Y＝23752X+2136（r＝0.9996，n＝6）。結果表明，芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的檢測濃度分別在25.96～259.65、2.15～21.55、31.63～316.30μg·mL－1范圍內與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

3.6 精密度試驗

分別取上述混合對照品溶液1000、500、200μL，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，制備成高、中、低濃度的溶液。分別在同日內連續進樣5次，計算日內精密度；在5 d內連續進樣5次，計算日間精密度。結果，芍藥苷、阿魏酸和甘草酸日內精密度的RSD分別為1.74%、1.05%和1.58%（n均為5）；日間精密度的RSD分別為2.76%、2.27%和2.62%（n均為5），表明儀器精密度良好。

3.7 重復性試驗

取同一批（批號:110715）抗乳腺小葉增生合劑適量，按“3.3”項下方法平行制成6份供試品溶液，照上述色譜條件測定。結果，芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的RSD分別為0.92%、1.15%和1.34%（n均為6），表明本方法重復性良好。

3.8 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批（批號:110715）抗乳腺小葉增生合劑適量，共6份，分別置于容量瓶中，再加入一定量的混合對照品溶液，按“3.3”項下方法制成供試品溶液，照上述色譜條件測定，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

3.9 樣品含量測定

取3批抗乳腺小葉增生合劑各適量，分別按“3.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定，以外標法計算各組分含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝5）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝5）

4 討論

本品共含有10味中藥，試驗選擇其中3味進行了TLC鑒別，其余藥味由于在試驗過程中發現干擾大、重復性較差等因素，故暫不納入標準。

采用HPLC法同時測定制劑中幾種組分的含量時，選擇合適的檢測波長尤為關鍵。筆者對芍藥苷、阿魏酸和甘草酸的對照品溶液分別進行全波長紫外掃描，確定芍藥苷最大吸收波長為230 nm，阿魏酸最大吸收波長為316 nm，甘草酸最大吸收波長為250 nm。在上述色譜條件下，分別于230、250、300、316、350 nm等波長處對供試品溶液進行分析，發現阿魏酸最大吸收波長316 nm附近的300 nm處所得的HPLC圖譜上各組分峰分離效果較好，雜質干擾峰亦被消除，且能較好地兼顧含量較小的阿魏酸的峰形，因此選擇300 nm作為檢測波長。

參考有關文獻[5，6]，經過對不同流動相的摸索，發現乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃（18∶80∶2）為流動相時，3組分的出峰時間更合適，峰形好、無拖尾，且不受雜質峰干擾。在流動相中加入少量的四氫呋喃，很好的改善了峰形。但四氫呋喃容易與流動相中的溶解氧形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260 nm波長以下），導致檢測靈敏度的輕微降低[7]，所以試驗流動相必須預先徹底脫氣。四氫呋喃易被氧化從而可能在色譜圖中產生倒峰，故添加四氫呋喃的流動相宜現用現配。

本品中白芍、當歸、甘草等均為主要藥味，方法學研究結果證明，采用TLC法對上述3味藥材進行定性鑒別，色譜斑點清晰、專屬性強。本試驗建立的以HPLC法同時測定芍藥苷、阿魏酸和甘草酸含量的方法靈敏度高、專屬性好，為其他制劑同時測定上述3種組分提供了方法參考。相比于文獻[8]中的調pH值后再用乙醚萃取的方法，本試驗中僅需對合劑稀釋即可進行含量測定，操作簡便易行。對3批樣品分別進行分析，測定結果準確、重復性好，說明筆者建立的質量標準可用于抗乳腺小葉增生合劑的質量控制。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄34、80-81、96-97、124-125.

[2]肖 萍，陳少卿.抗乳腺小葉增生合劑的制備與臨床應用[J].中國藥師，2008，11（6）:727.

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[7]張慶合.高效液相色譜實用手冊[M].北京:化學工業出版社，2008:83.

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