調肝止痛膠囊的質量標準研究

鄭琰，王芳，談靜，曾倩（.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，成都 6007；.成都中醫(yī)藥大學，成都 6007）

調肝止痛膠囊是由白芍、丹參、枳殼和沒藥等8味藥材組成的中藥復方制劑，具有養(yǎng)血益肝、行氣活血、祛瘀止痛的功效，在臨床上用于治療肝郁血瘀型痛經(jīng)。筆者對方中白芍、丹參、枳殼和沒藥進行薄層色譜（TLC）鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法測定了方中主藥白芍有效成分芍藥苷的含量，建立了調肝止痛膠囊的質量標準，為該制劑的質量控制提供了簡單、快速、可靠的方法。

1 儀器與試藥

1100 HPLC儀，包括1100系列二級泵、二極管陣列檢測器、化學工作站（美國Agilent公司）；BP211D分析天平（德國Sartorius公司）；SB3200超聲波清洗機（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠，功率:280 W，頻率:40 kHz）；ZF-90暗箱式紫外透射儀（上海顧村電光儀器廠）。

芍藥苷、丹參酮ⅡA、柚皮苷對照品（供鑒別用，批號分別為110736-200933、110726-200518、110722-200610），白芍、丹參、枳殼、沒藥對照藥材（供鑒別用，批號分別為120905-200508、120923-200610、120981-200403、121250-200503），芍藥苷對照品（供含量測定用，批號:110736-200933）均由中國食品藥品檢定研究院提供；調肝止痛膠囊（批號:20100301、20100302、20100303）及其相應陰性樣品（批號:20100311、20100312、20100313、20100314）均由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室提供；硅膠G（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別[1，2]

2.1.1 白芍的TLC鑒別 取本品內容物1 g，加乙醇10mL，超聲處理30min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液；取白芍對照藥材0.5 g和陰性樣品1 g，同法分別制成對照藥材溶液和陰性對照溶液；另取芍藥苷對照品適量，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述4種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的藍紫色斑點；陰性對照無干擾。白芍的TLC見圖1。

2.1.2 枳殼的TLC鑒別 取本品內容物0.7 g，加甲醇10mL，超聲處理30min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇5mL使溶解，作為供試品溶液；取枳殼對照藥材0.2 g和陰性樣品0.7 g，同法分別制成對照藥材溶液和陰性對照溶液；另取柚皮苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述4種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶6∶2）下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，于105℃加熱約5min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。枳殼的TLC見圖2。

圖1 白芍的TLC1.對照品；2.對照藥材；3～5.供試品；6.陰性對照Fig 1 TLC of Paeonia lactiflora1.substance control；2.reference substance；3～5.test samples；6.negative control

2.1.3 丹參的TLC鑒別 取本品內容物3 g，加乙醚5mL，振搖，放置1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作為供試品溶液；取丹參對照藥材1 g和陰性樣品3 g，同法分別制成對照藥材溶液和陰性對照溶液；另取丹參酮ⅡA對照品適量，加乙酸乙酯制成每1mL含2mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述4種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。丹參的TLC見圖3。

2.1.4 沒藥的TLC鑒別 取本品內容物10 g，加乙醇50mL，超聲15min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加乙醇5mL使溶解，作為供試品溶液；取沒藥對照藥材0.2 g和陰性樣品10 g，同法分別制成對照藥材溶液和陰性對照溶液。照TLC法[2]試驗，吸取上述3種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。沒藥的TLC見圖4。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[2]色譜柱:Hypersil ODS-C18（150mm×4.6mm，5.0μm）；流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）；流速:1.0mL·min－1；柱溫:20 ℃；檢測波長:230 nm；進樣量:10μL。理論板數(shù)按芍藥苷色譜峰計算應不低于2000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品5.75mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖2 枳殼的TLC1.對照品；2.對照藥材；3～5.供試品；6.陰性對照Fig 2 TLC of Citrus aurantium1.substance control；2.reference substance；3～5.test samples；6.negative control

圖3 丹參的TLC1.對照品；2.對照藥材；3～5.供試品；6.陰性對照Fig 3 TLC of Salvia miltiorrhiza1.substance control；2.reference substance；3～5.test samples；6.negative control

圖4 沒藥的TLC1、2.對照藥材；3～5.供試品；6.陰性對照Fig 4 TLC of Myrrha1，2.reference substance；3～5.test samples；6.negative control

2.2.3 供試品溶液的制備[3，4]取本品內容物約0.2 g，精密稱定，置50mL容量瓶中，加50%乙醇30mL，超聲處理30min，放至室溫，加50%乙醇至刻度，搖勻，離心，上清液用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取缺白芍的陰性樣品約0.2 g，精密稱定，置50mL容量瓶中，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 空白試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μL，按上述色譜條件進樣測定。結果，供試品溶液在與芍藥苷對照品溶液相應保留時間處有相同的色譜峰出現(xiàn)，陰性對照溶液則無，表明在此色譜條件下，樣品中其他成分對芍藥苷的測定無干擾。色譜見圖5。

圖5 高效液相色譜圖A.芍藥苷對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.芍藥苷Fig 5 HPLC chromatogramsA.paeoniflorin control；B.test sample；C.negative control；1.paeoniflorin；

2.2.6 線性關系考察 分別精密吸取芍藥苷對照品溶液（115 μg·mL－1）1、3、5、8、10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，芍藥苷進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝1501.25518X+9.51630（r＝0.9999，n＝5）。結果表明，芍藥苷進樣量在0.115～1.150μg范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系，

2.2.7 精密度試驗 精密吸取芍藥苷對照品溶液10μL，重復進樣6次，按上述色譜條件測定。結果，RSD＝1.02%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣，按上述色譜條件測定。結果，RSD＝0.58%（n＝7），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.2.9 重復性試驗 取同一批（批號:20100301）樣品適量，共6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定。結果，芍藥苷的平均含量為7.240mg·g－1，RSD＝1.07%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批樣品9份，每份約0.1 g，精密稱定，分別精密加入芍藥苷對照品溶液適量，照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

2.2.11 樣品含量測定 取3個批號的調肝止痛膠囊，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定含量。結果，3批樣品（批號:20100301、20100302、20100303）中芍藥苷的含量分別為7.1508、7.0661、7.6973mg·g－1。

3 討論

白芍為方中主藥，對其進行定性、定量分析具有重要意義。本試驗采用TLC法對其進行定性鑒別，采用HPLC法對其有效成分芍藥苷進行含量測定，所建方法操作簡便、專屬性強、重復性好、陰性無干擾，可用于該制劑的質量控制。

中藥復方制劑以芍藥苷含量為測定指標的文獻報道很多，筆者參考有關文獻對多種流動相進行了考察。結果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）作為流動相，芍藥苷峰形對稱，色譜峰之間分離較好。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

在含量測定中，分別對供試品溶液制備過程中的提取溶媒、提取方法和提取時間進行了考察[5，6]。提取溶媒考察中，分別采用甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇提取，結果采用50%甲醇、50%乙醇干擾少，峰形較好，而甲醇、乙醇干擾較大，從經(jīng)濟方面考慮，最終選用50%乙醇作為提取溶劑。提取方法考察中，分別采用靜置、超聲、回流、溫浸法提取樣品，結果以超聲、回流法提取效果較好，因超聲提取簡便，故采用超聲提取方法。提取時間考察中，分別考察了超聲處理15、30、45、60min對芍藥苷含量的影響，結果在30～60min內含量變化不大，故選提取時間為30min。

綜合考慮《醫(yī)療機構制劑注冊管理辦法》的要求和醫(yī)院制劑多批次小批量的特點，本試驗研究了白芍、丹參、枳殼、沒藥的TLC鑒別方法和芍藥苷的含量測定方法，所建立的標準可有效地控制該制劑的質量。此外，對方中其余4味藥物的定性鑒別方法有待進一步研究。

[1]呂武清，龍新華.中成藥中的藥材薄層色譜鑒別[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1997:151、192、315、378.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:96、附錄34.

[3]葉 娟，高文遠，劉新橋，等.白芍配方顆粒制備工藝優(yōu)化及質量控制[J].中國藥房，2007，18（9）:661.

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