HPLC法同時(shí)測(cè)定綠茶中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和咖啡因的含量

李元宏，田 華，陳吉炎（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰 442000）

綠茶在我國(guó)已有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，因其具有多種生理作用和藥理活性，人們對(duì)其研究越來(lái)越深入，尤其是綠茶中含量較高、用途廣泛的茶多酚和咖啡因更是如此。茶多酚是一類(lèi)多羥基酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)，具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、降血壓、抑菌、抗癌、抗輻射、抗病毒等重要作用[1，2]，其中以表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）含量最高，占40%～50%[3]。咖啡因是一種生物堿，具有增加腎臟血流量、強(qiáng)心、利尿、興奮神經(jīng)中樞、消除疲勞等作用。筆者以高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定綠茶中EGCC和咖啡因的含量，以利于綠茶的質(zhì)量控制[4]。

1 儀器與試藥

LC-10A型HPLC儀、SPD-10A型紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；HW-2000型色譜工作站（南京千譜軟件有限公司）；FA2004型電子分析天平（上海精科公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率:150 W，頻率:30 kHz）。

EGCG標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司，純度＞98%）；咖啡因?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):171215-200809）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。綠茶采自武當(dāng)山八仙觀茶場(chǎng)，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室陳吉炎教授鑒定為茶Camellia sinensis（L.）O.Ktze.的芽葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:DiamonsilTMC18（200mm×4.6mm，5 μm），加裝Phenomenex保護(hù)柱；流動(dòng)相:甲醇-0.1%冰醋酸水溶液（25∶75）；流速:1.0mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng):278 nm[5]；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:10μL。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；1.咖啡因；2.EGCGFig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；1.caffeine；2.EGCG

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取經(jīng)真空干燥至恒重的EGCG標(biāo)準(zhǔn)品和咖啡因?qū)φ掌犯鬟m量，用甲醇配成每1mL中含EGCG 25.0mg和咖啡因5.0mg的混合對(duì)照品貯備液。精密量取該貯備液10mL，置100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取綠茶粉末約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入乙醇25mL，超聲處理30min，濾過(guò)，濾渣用適量乙醇洗滌，合并濾液，乙醇定容至50mL，搖勻。精密量取2mL，置蒸發(fā)皿中，揮干，殘?jiān)迫?0mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取上述混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mL，分別置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10μL，注入HPLC儀，每一濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，求平均峰面積。以平均峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得EGCG和咖啡因的回歸方程分別為Y＝1.178×107X+5.947×105（r＝0.9994，n＝6）、Y＝2.376×107X－2.278×104（r＝0.9996，n＝6）。結(jié)果表明，EGCG和咖啡因的進(jìn)樣量分別在1.25～10.00、0.25～2.00μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，EGCG和咖啡因的RSD分別為0.76%和1.02%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的綠茶粉末（約1.0 g）6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果，EGCG和咖啡因的RSD分別為1.21%和1.46%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、24h各進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果，EGCG和咖啡因的RSD分別為1.32%和1.63%（n＝6），表明供試品溶液在制備后24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的同一批綠茶粉末（約1.0 g）6份，分別精密加入混合對(duì)照品貯備液2mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后，取續(xù)濾液進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品含量和加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取3批綠茶粉末各約1.0 g，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后，取續(xù)濾液進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Result of content determination of samples（n＝3）

3 討論

樣品含量測(cè)定結(jié)果表明，不同批次的綠茶中所含的活性成分有一定差異，有的差異還很顯著。可見(jiàn)，從有效成分層面來(lái)控制綠茶質(zhì)量是不容忽視的問(wèn)題。

由于綠茶所含成分比較復(fù)雜，除含量較高的EGCG和咖啡因外，還含有不少低含量或是弱吸收的成分。因此，用色譜方法來(lái)分析和控制綠茶質(zhì)量時(shí)，色譜峰的分離度是必須注意的問(wèn)題。試驗(yàn)中通過(guò)調(diào)整色譜條件使保留時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，各組分可獲得較好分離。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于綠茶的質(zhì)量控制。

[1]袁曄蓉.淺談茶多酚的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2007，18（9）:700.

[2]賈淑平，曾 睿，但衛(wèi)華，等.植物多酚藥理作用的研究及應(yīng)用[J].中國(guó)藥房，2009，20（12）:953.

[3]仉燕崍，李 楠，韓國(guó)柱，等.表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的研究進(jìn)展[J].中草藥，2006，37（2）:303.

[4]李自勇，喻宗沉，徐小軍，等.茶多酚含量與兒茶素含量關(guān)系研究[J].化學(xué)與生物工程，2007，24（11）:73.

[5]王菊萍，呂 萍.反相高效液相色譜法測(cè)定茶多酚中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，16（15）:2306.