Ki-67在乳腺癌各亞型中的表達及意義

朱偉良 談炎 王旭芬 程錦玲 張磊 方琦 談珂嵐 楊瀾 王磊

常州市第一人民醫院乳腺外科，△病理科，江蘇 常州 213003

Ki-67在乳腺癌各亞型中的表達及意義

朱偉良 談炎△王旭芬 程錦玲 張磊 方琦 談珂嵐 楊瀾 王磊

常州市第一人民醫院乳腺外科，△病理科，江蘇 常州 213003

背景與目的：目前公認的指導乳腺癌治療和預后預測的生物學指標有雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone，PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)。近年來Ki-67逐漸成為一個新的研究熱點，眾多研究提示，Ki-67很可能是繼HER-2之后又一個重要的生物指標。本研究旨在分析Ki-67在不同亞型的乳腺癌中的表達及臨床意義。方法：收集常州市第一人民醫院乳腺外科2010年1月—12月收治的252例乳腺癌患者的臨床病理資料，通過免疫組化(immunohistochemistry，IHC)方法測定手術后乳腺癌組織的ER、PR、HER-2和Ki-67的表達以區分不同的乳腺癌亞型。結果：Ki-67指數在不同年齡及不同淋巴結轉移狀態間差異無統計學意義(P＞0.05)。腫瘤直徑＞2 cm的患者Ki-67指數顯著高于直徑≤2 cm的患者(P=0.001)。病理分期為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者的Ki-67指數均顯著高于病理分期為0期的患者(P＜0.05)，但是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者間的Ki-67指數差異無統計學意義(P＞0.05)。ER陰性、PR陰性、HER-2陽性的患者的Ki-67指數均顯著高于其對應的ER陽性、PR陽性和HER-2陰性的患者(P＜0.05)。Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型的Ki-67指數均顯著高于Luminal A型(P＜0.001)，而Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型三者間的Ki-67指數差異無統計學意義(P＞0.05)。結論：Ki-67結合其他生物指標對預測乳腺癌的預后有一定意義，值得和ER、PR和HER-2同時進行檢測。

乳腺癌；臨床病理特征；Ki-67；雌激素受體；孕激素受體；人表皮生長因子受體2

雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone，PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)是目前公認的指導乳腺癌治療和預后預測的生物學指標。近年來，Ki-67逐漸成為一個新的研究熱點。本研究通過對252例乳腺癌患者的臨床資料進行分析，探討Ki-67在乳腺癌各亞型中的表達及臨床意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取常州市第一人民醫院2010年1月—2010年12月接受手術治療的乳腺癌患者，篩選出滿足下列條件的病例：①女性；②可手術；③術后均經常規石蠟切片病理檢查確診為乳腺癌；④進行了腋窩淋巴結清掃；⑤術前未接受過放療、化療和內分泌治療。共獲得252例乳腺癌患者的臨床病理資料。患者年齡20～83歲，中位年齡54歲，年齡≤35歲者11例(4.4%)，>35歲者241例(95.6%)。Tis10例(4.0%)，T1117例(46.4%)，T2121例(48.0%)，T33例(1.2%)，T41例(0.4%)。腋窩淋巴結有轉移者89例(35.3%)，無轉移者163例(64.7%)。按照第六版AJCC乳腺癌TNM病理分期標準：0期10例(4.0%)，Ⅰ期85例(33.7%)，Ⅱ期124例(49.2%)，Ⅲ期33例(13.1%)。組織學類型：浸潤性導管癌227例(90.1%)，浸潤性小葉癌5例(2.0%)，導管原位癌10例(4.0%)，其他類型10例(4.0%)。

1.2 試劑

SP9000試劑盒及免疫組化染色一抗Ki-67(ZM0166)、HER-2(ZM0065)、ER(ZA0102)、PR(ZA0255)。

1.3 免疫組化檢測

采用免疫組化二步法(以PV-9000通用型二步法檢測試劑盒為例)進行病理診斷。石蠟切片脫蠟，蒸餾水沖洗后，PBS浸泡5 min，置于pH為6.0的枸櫞酸緩沖液中，在高壓鍋中，于120 ℃抗原修復6 min，冷卻至室溫。采用3%H2O2室溫溫育5～10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗共3次，每次2 min。分別滴加Ki-67、HER-2、ER、PR一抗工作液，37 ℃溫育1～2 h或4 ℃過夜。PBS沖洗3次，每次2 min。滴加試劑1(Polymer Helper)，室溫或37℃溫育20 min，PBS沖洗3次，每次2 min。滴加試劑2(多聚過氧化物酶抗鼠及抗兔抗體)，室溫或37 ℃溫育20～30 min，PBS沖洗3次，每次2 min。DAB顯色劑顯色4～8 min。自來水充分沖洗，蘇木素復染，脫水透明、封片。

1.4 結果判定

ER和PR陽性判斷標準：腫瘤細胞無細胞核棕黃染色或少于5%的細胞核較弱棕黃染色為陰性，>5%的細胞核棕黃染色則為陽性。Ki-67陽性染色定位于細胞核，按視野中陽性細胞所占的比例進行計數，以任意5個高倍鏡視野中陽性細胞所占比例的平均值定義為陽性細胞百分比并作為評定依據。HER-2陽性判斷標準：細胞膜棕黃染色為陽性。無細胞染色或<10%的細胞膜較弱染色為(-)；>10%的細胞膜部分較弱染色為(+)；>10%的細胞膜完全較弱到中等染色為(++)；>10%的細胞膜完全強染色為(+++)。由于未對HER-2(++)的病例進一步進行FISH檢測，本研究將檢查結果(++)及以下者定義為陰性，(+++)者定義為陽性。

1.5 統計學處理

采用SPSS 16.0統計軟件包進行統計處理，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Ki-67指數與臨床病理特征的關系

Ki-67在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達情況見圖1和圖2。年齡≤35歲和＞35歲的患者間Ki-67指數差異無統計學意義(P=0.087)。腫瘤直徑＞2 cm的患者Ki-67指數高于腫瘤直徑≤2 cm者(P=0.001)。淋巴結無轉移和有轉移間Ki-67指數差異無統計學意義(P=0.297)。病理分期為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期者的Ki-67指數均顯著高于病理分期為0期者(P<0.05)，但Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期三者間的Ki-67指數差異無統計學意義(P>0.05)。ER(-)者的Ki-67指數顯著高于ER(+)者(P<0.001)。PR(-)者的Ki-67指數顯著高于PR(+)者(P<0.001)。HER-2(+)者的Ki-67指數顯著高于HER-2(-)者(P=0.013，表1)。

2.2 Ki-67指數與乳腺癌亞型的關系

Luminal A型76例(30.2%)，Ki-67指數均值為7.28。Luminal B型98例(38.9%)，Ki-67指數均值為33.21。HER-2過表達型16例(6.3%)，Ki-67指數均值為35.31。三陰型62例(24.6%)，Ki-67指數均值為36.0(表2)。

表 2 Ki-67與乳腺癌亞型的關系Tab. 2 The relationship between Ki-67 and subtype of breast cancer

Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型的Ki-67指數均顯著高于Luminal A型(P<0.001)。Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型三者間的Ki-67指數差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

Ki-67是1983年由Gerdes等發現的一種在增殖細胞中表達的核抗原。Ki-67抗原在G0期不表達，在G1期和S期早期表達水平比較低，在S期后期和G2期表達明顯增加，在M期達到高峰，在細胞分裂的后期和末期迅速下降。鑒于Ki-67的這個特點，其被認為是有效評估細胞增殖的一個重要指標。有研究發現，Ki-67在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達存在差異，正常乳腺組織和臨近乳腺纖維腺瘤的乳腺組織中Ki-67呈低表達(<3%)［1-3］。Fasanella等［4］報道315例乳腺癌的Ki-67陽性指數為36%±14%，與本研究結果有一定差異。

本研究結果顯示，Ki-67在不同年齡的患者之間差異無統計學意義(P=0.087)。關于Ki-67和腫瘤大小的關系，有研究結果顯示，兩者呈正相關［5-6］，亦有研究結果顯示，兩者間無關［7］或者呈負相關［8］。本研究結果顯示，腫瘤較大者Ki-67指數較高(P=0.001)。對于Ki-67和腋窩淋巴結轉移的關系，大部分研究認為，Ki-67和淋巴結轉移呈正相關［8］，也有研究認為兩者無關［7，9-10］，還有研究報道呈負相關［11］。本研究的結果顯示，Ki-67與淋巴結轉移無明顯相關(P=0.297)。Ki-67與病理分期相關(P=0.027)，進一步分析的結果顯示，病理分期為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期的患者Ki-67指數均顯著高于病理分期為0期者(P<0.05)，但Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期三者間的Ki-67指數差異無統計學意義(P>0.05)。結果提示，Ki-67指數主要與腫瘤局部的增殖相關，不能反應區域淋巴結的狀態。

目前，多數研究認為Ki-67與ER、PR呈負相關［5，9-10，12-14］，也有報道呈正相關［15］。本研究結果顯示，ER、PR表達陰性者Ki-67指數顯著高于ER、PR表達陽性者(P<0.001)。由于ER、PR陽性的乳腺癌對內分泌治療敏感，預后較ER、PR陰性的乳腺癌好，可以推測Ki-67高表達的乳腺癌患者預后可能較差。目前已有數個研究證實，Ki-67和HER-2表達呈正相關［10，13，16］，但也有負相關的報道［17-18］。本研究結果顯示，HER-2陽性者Ki-67指數顯著高于HER-2陰性者(P=0.013)。由于HER-2過度表 達的乳腺癌患者預后較差已成定論，可以由此推測Ki-67高表達的乳腺癌患者預后較差。

本研究中的三陰型乳腺癌患者共62例(24.6%)，其比例與周波等［19］報道的26.8%接近。進一步發現不同的乳腺癌亞型的Ki-67指數有一定區別。Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型的Ki-67指數均顯著高于Luminal A型(P<0.001)，而Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型三者間的Ki-67指數差異無統計學意義(P>0.05)。

本研究結果提示，在乳腺癌的發生、發展過程中，Ki-67與ER、PR、HER-2之間可能存在著特殊的關系，Ki-67高表達可能是一個不良預后因素。由于目前尚缺乏統一的Ki-67檢測和評估方案，而且缺乏大樣本的前瞻性研究，Ki-67還不能作為公認的乳腺癌預后指標。盡管如此，Ki-67很可能是繼HER-2之后的又一個重要的生物指標［20］，將在乳腺癌的預后和指導治療方面發揮越來越重要的作用。

［1］HARPER-WYNNE C, ROSS G, SACKS N, et al. Effects of the aromatase inhibitor letrozole on normal breast epithelial cell proliferation and metabolic indices in postmenopausal women: a pilot study for breast cancer prevention［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2002, 11(7): 614-621.

［2］CLARKE R B, HOWELL A, POTTEN C S, et al. Dissociation between steroid receptor expression and cell proliferation in the human breast［J］. Cancer Res, 1997, 57(22): 4987-4991.

［3］de LIMA G R, FACINA G, SHIDA J Y, et al. Effects of low dose tamoxifen on normal breast tissue from premenopausal women［J］. Eur J Cancer, 2003, 39(7): 891-898.

［4］FASANELLA S, LEONARDI E, CANTALONI C, et al.Proliferative activity in human breast cancer: Ki-67 automated evaluation and the influence of different Ki-67 equivalent antibodies［J］. Diagn Pathol, 2011, 6(Suppl 1): 7.

［5］LIU S, EDGERTON S M, MOORE D H 2ND, et al. Measures of cell turn over (proliferation and apoptosis) and their association with survival in breast cancer［J］. Clin Cancer Res, 2001, 7(6): 1716-1723.

［6］MOLINO A, MICCIOLO R, TURAZZA M, et al. Ki-67 immunostaining in 322 primary breast cancers: associations with clinical and pathological variables and prognosis［J］.Int J Cancer, 1997, 74(4): 433-437.

［7］BHATAVDEKAR J M, PATEL D D, SHAH N G, et al.Prognostic significance of immunohistochemically localized biomarkers in stage Ⅱ and stage Ⅲ breast cancer: a multivariate analysis［J］. Ann Surg Oncol, 2000, 7(4): 305-311.

［8］BROWN R W, ALLRED C D, CLARK G M, et al. Prognostic value of Ki-67 compared to S-phase fraction in axillary nodenegative breast cancer［J］. Clin Cancer Res, 1996, 2(3):585-592.

［9］SPYRATOS F, FERRERO-POUS M, TRASSARD M, et al.Correlation between MIB-1 and other proliferation markers:clinical implications of the MIB-1 cut off value［J］. Cancer,2002, 94(8): 2151-2159.

［10］BOTTINI A, BERRUTI A, BERSIGA A, et al. Relationship between tumour shrinkage and reduction in Ki-67 expression after primary chemotherapy in human breast cancer［J］. Br J Cancer, 2001, 85(8): 1106-1112.

［11］WEIKEL W, BECK T, MITZE M, et al. Immunohistochemical evaluation of growth fractions in human breast cancers using monoclonal antibody Ki-67［J］. Breast Cancer Res Treat,1991, 18(3): 149-154.

［12］BADER AA, TIO J, PETRU E, et al. T1breast cancer:identification of patients at low risk of axillary lymph node metastases［J］. Breast Cancer Res Treat, 2002, 76(1): 11-17.

［13］TRIHIA H, MURRAY S, PRICE K, et al. Ki-67 expression in breast carcinoma: its association with grading systems, clinical parameters, and other prognostic factors--a surrogate marker?［J］. Cancer, 2003, 97(5): 1321-1331.

［14］URRUTICOECHEA A, SMITH I E, DOWSETT M.Proliferation marker Ki-67 in early breast cancer［J］. J Clin Oncol, 2005, 23(28): 7212-7220.

［15］PINDER S E, WENCYK P, SIBBERING D M, et al.Assessment of the new proliferation marker MIB1 in breast carcinoma using image analysis: associations with other prognostic factors and survival［J］. Br J Cancer, 1995,71(1): 146-149.

［16］RUDOLPH P, OLSSON H, BONATZ G, et al. Correlation between p53, c-erbB-2, and topoisomerase Ⅱ alpha expression, DNA ploidy, hormonal receptor status and proliferation in 356 node-negative breast carcinomas:prognostic implications［J］. J Pathol, 1999, 187(2): 207-216.

［17］GASPARINI G, POZZA F, MELI S, et al. Breast cancer cell kinetics: immunocytochemical determination of growth fractions by monoclonal antibody Ki-67 and correlation with flow cytometric S-phase and with some features of tumor aggressiveness［J］. Anticancer Res, 1991, 11(6): 2015-2021.

［18］NICHOLSON R I, MCCLELLAND R A, FINLAY P, et al.Relationship between EGF-R, c-erbB-2 protein expression and Ki-67 immunostaining in breast cancer and hormone sensitivity［J］. Eur J Cancer, 1993, 29(7): 1018-1023.

［19］周波, 謝菲, 王思源, 等. 紫杉類聯合蒽環類的新輔助化療方案治療三陰乳腺癌的療效及預后［J］. 中國癌癥雜志,2009, 19(2): 129-132.

［20］CUZICK J, DOWSETT M, PINEDA S, et al. Prognostic value of a combined estrogen receptor, progesterone receptor,Ki-67, and human epidermal growth factor receptor 2 immunohistochemical score and comparison with the genomic health recurrence score in early breast cancer［J］. J Clin Oncol, 2011, 29(32): 4273-4278.

The expression and significance of Ki-67 in different subtype of breast cancer

ZHU Wei-liang,TAN Yan, WANG Xu-fen, CHENG Jin-ling, ZHANG Lei, FANG Qi, TAN Ke-lan, YANG Lan, WANG Lei(Department of Breast Surgery, The First People’s Hospital of Changzhou, Changzhou Jiangsu 213003, China)

ZHU Wei-liang E-mail：lancezwl@sina.com

Background and purpose：The established prognostic and predictive parameters of breast cancer were estrogen-receptor (ER), progesterone-receptor (PR) and human epidermal growth factor receptor-2 (HER-2) status.The Ki-67 is now becoming a new research focus, and many researches showed that Ki-67 is an important biomarker after HER-2. This research aimed to study the expression and significance of Ki-67 in different subtypes of breast cancer.Methods：Clinical and pathological data of breast cancer patients, treated in Department of Breast Surgery, The First People’s Hospital of Changzhou from Jan. 2010 to Dec. 2010, were collected and analyzed. Immunohistochemical method was used to detect the expression of ER, PR, HER-2 and Ki-67 of these patients.Results：There were no correlations between the expression of Ki-67 and age or node metastasis of breast cancer patients, although there were significant differences in different tumor size of patients (P=0.001). The expressions of Ki-67 in stage Ⅰ, Ⅱ and Ⅲpatients were significantly higher than those in stage 0 patients, while there was no significant difference between the three mutually. The expressions of Ki-67 in ER negative patients were significantly higher than ER positive patients,and this trendency extended to PR negative and HER-2 positive patients (P＜0.05). The expressions of Ki-67 in Luminal B subtype, HER-2 over-expression subtype and basal like subtype were significantly higher than in Luminal A subtype(P＜0.001), but there was no significant difference between the three mutually.Conclusion：Ki-67 provides prognostic information combined with other biologic markers, and co-detection of Ki-67, ER, PR and HER-2 may be useful.

Breast cancer; Clinicopathological characteristics; Ki-67; ER; PR; HER-2

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.05.005

R737.9

A

1007-3639(2012)05-0347-05

朱偉良 E-mail:lancezwl@sina.com

2011-12-02

2012-04-02）