砂仁中總黃酮的提取工藝研究

王文杰，史 歡，黃國旺，史 航，謝 亮，郭豫梅

(陜西理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723001)

砂仁 (amomum fruit)是一種多年生草本植物，生長于山谷林下、陰濕地，其果實(shí)是常見的中藥，可行氣和中、開胃消食、養(yǎng)脾止瀉、理氣安胎，也常被人們看做滋補(bǔ)品。其成分主要有黃酮類化合物以及檸檬烯和皂素。

黃酮［1-9］類化合物也稱類黃酮，是具有乙─苯基吡喃酮結(jié)構(gòu)的一類黃色素。黃酮類化合物在植物界分布很廣，主要存在于蕓香科、豆科、傘形科中。類黃酮對緩解頭痛、抑制血小板凝結(jié)、防癌抗癌、消炎、抗?jié)儭⒔笛堑榷加蟹浅ｏ@著的功效。類黃酮可以從食物中獲得，也可以從富含黃酮類化合物的植物中提取。對從砂仁中提取總黃酮的工藝進(jìn)行了研究，現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

砂仁，購于漢中市市場;無水乙醇，石油醚，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，所用試劑均屬AR級;蘆丁 ［中國醫(yī)藥 (集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司］，為生化試劑。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，粉碎機(jī) (天津市泰斯特儀器有限公司)，電熱恒溫水浴鍋 (北京科偉永興儀器有限公司)，722E型分光光度計(jì) (上海光譜儀器有限公司)，AL204-IC型電子天平 (上海志榮電子科技有限公司)，800型離心沉淀器 (上海手術(shù)器械廠)，SHB-III型臺(tái)式循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)和索式提取器 (金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

將砂仁去殼后置于60℃的烘箱烘干，粉碎，用石油醚回流除去色素和脂，風(fēng)干，待用。

1.2.2 最大吸收波長的確定

精確稱取經(jīng)充分干燥的蘆丁樣品15mg，用乙醇定容至100mL容量瓶中，配制成0.15mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管移取 1.00mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL容量瓶中，加入30%的乙醇溶液8mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.4mL振蕩放置5min;加10%硝酸鋁溶液0.4mL，搖勻，再放置5min;加4%氫氧化鈉8mL，用30%乙醇定容至刻度。10min后，以加入 5% 亞硝酸鈉、10%硝酸鋁和 4%氫氧化鈉的30%乙醇溶液為空白對照，用1 cm比色皿在480～570 nm波長范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取經(jīng)60℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0mg，以60%乙醇溶解定容至100mL的容量瓶中，配制成0.2mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確 吸 取 0.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00mL，分別置于25mL的容量瓶中，各加30%乙醇溶液至8mL，再加5%亞硝酸鈉溶液0.4mL，振搖后放置6min;加10%硝酸鋁溶液0.4mL，振搖后放置6min;加4% 氫氧化鈉溶液8mL，最后用30%乙醇定容至刻度，放置10min后，以相應(yīng)的溶劑做空白，在試驗(yàn)確定的最大吸收波長下測其吸光度。以濃度 (x，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以吸光度 (D)為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 總黃酮含量的測定

稱取1mL浸提濾液按照1.2.2過程處理后測定其吸光度。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出黃酮的提取率，其計(jì)算公式為:黃酮提取率/%=總黃酮的濃度(mg·mL-1) ×的稀釋倍數(shù) ×提取液體積 (mL)×10-3×100/砂仁樣品的質(zhì)量 (g)。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間為4個(gè)單因素，固定其中某3個(gè)因素以1個(gè)因素為變量分別進(jìn)行試驗(yàn)，研究4個(gè)變量各自對總黃酮提取效率的影響。

乙醇濃度。稱取1.000 g砂仁樣品粉末5份，在提取溫度為60℃，料液比為1∶70、分別以50%，60%，70%，80%，90%的乙醇濃度提取2 h。過濾，濾液按1.2.2的方法處理后測定吸光值。每一變量下都做平行試驗(yàn)。

料液比。稱取1.000 g樣品粉末5份，在乙醇濃度為 80%，溫度為60℃，以料液比為1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90的比例提取 2 h，過濾，濾液按照1.2.2的方法處理后測定吸光值。每一變量下都做平行試驗(yàn)。

提取溫度。稱取1.000 g砂仁樣品粉末5份，在乙醇濃度為 80%，料液比為1∶70，以40℃，50℃，60℃，70℃，80℃的溫度提取 2 h。過濾，濾液按1.2.2的方法處理后測定其吸光值。每一變量下都做平行試驗(yàn)。

提取時(shí)間。稱取1.000 g樣品粉末5份，在乙醇濃度為80%，溫度為60℃，料液比為1∶70，分別提取1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h。過濾，濾液按1.2.2的方法處理后測定其吸光值。每一變量下都做平行試驗(yàn)。

1.2.6 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度為因素，選用L9(34)正交［8-11］表確定最佳的提取工藝 (表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長和標(biāo)準(zhǔn)曲線

以試驗(yàn)所用的722E型分光光度計(jì)在480～570 nm的范圍內(nèi)掃描蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試液，發(fā)現(xiàn)在508 nm處有最大吸收值，此即為最大吸收波長。

表1 砂仁總黃酮提取正交試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.3方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得到蘆丁濃度與吸光值的回歸方程式為:D=10.434x+0.0017，R2=0.9985，表明蘆丁濃度在這一范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 (圖1)。

圖1 蘆丁含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素影響

2.2.1 乙醇濃度

從圖2可以看出，在隨著乙醇濃度的增加總黃酮的提取率也隨之增加，當(dāng)乙醇濃度增加至80%時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加乙醇濃度則發(fā)現(xiàn)總黃酮的提取率有所下降。這是由于乙醇濃度的增加，一方面使整個(gè)提取液的極性增加，與砂仁中黃酮類化合物的極性不相符，黃酮類化合物不能很好的溶入提取液中;另一方面，乙醇濃度增大后一些脂溶性物質(zhì)開始溶入提取液，這些物質(zhì)和黃酮類化合物發(fā)生與乙醇—水分子結(jié)合的競爭，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的提取率下降。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

2.2.2 料液比

由圖3可以看出總黃酮的提取率隨料液比的增大而增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶80時(shí)達(dá)最大值，之后繼續(xù)增大料液比總黃酮的提取率反而下降，這表明在料液比為1∶80時(shí)總黃酮已經(jīng)很好地溶解在乙醇中。因此最佳料液比應(yīng)為1∶80。

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響

2.2.3 溫度

圖4看出，隨溫度的升高，總黃酮的提取率隨著升高，在60℃時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)闇囟壬叻肿舆\(yùn)動(dòng)加快，乙醇溶液容易浸入砂仁細(xì)胞，使黃酮類化合物更好地溶于乙醇中。繼續(xù)升高溫度后總黃酮提取率略有下降，這是因?yàn)闇囟冗^高，使黃酮類化合物氧化或分解，導(dǎo)致有效提取量下降［6］，直接反映出吸光度下降。這表明60℃為最佳提取溫度。

圖4 溫度對總黃酮提取率的影響

2.2.4 提取時(shí)間

從圖5可以看出隨著提取時(shí)間的延長，乙醇能充分浸入砂仁細(xì)胞中，使得提取率隨之提高。當(dāng)時(shí)間超過2.5 h后提取率呈下降趨勢。這是因?yàn)?一方面提取時(shí)間延長砂仁中脂類物質(zhì)較多溶于提取液，與黃酮類化合物競爭與乙醇—水分子的結(jié)合;另一方面時(shí)間延長部分黃酮類化合物會(huì)被氧化或分解，所以導(dǎo)致提取率下降。由此可知，2.5 h為最佳提取時(shí)間。

圖5 提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響

2.3 多因素影響

由表1可知，4個(gè)試驗(yàn)因素對砂仁總黃酮提取率的影響強(qiáng)弱次序?yàn)?乙醇濃度＞溫度＞料液比＞提取時(shí)間。最佳提取條件為A3C2D2B2，即用80%的乙醇濃度、60℃、1∶80的料液比，提取2.5 h的提取率最高。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，砂仁中總黃酮用乙醇提取的最佳條件為80%的乙醇濃度，60℃ 的提取溫度，1∶80的料液比提取2.5 h。以乙醇作為提取溶劑可以除去一些親水性蛋白質(zhì)、多糖、及其他水溶性雜質(zhì)，提取液中有少量沉淀，可用離心的方法除去沉淀。另外，以乙醇做提取溶劑毒性較小，價(jià)格便宜。

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