低氧預適應對小鼠大腦HIF-α表達的影響

高冰 張勝 姜樹原 周立社 邵國

低氧預適應(hypoxicpreconditioning)是指預先給予1次或多次短暫、非致死性低氧刺激后，機體獲得了對更嚴重甚至致死性缺血或缺氧的耐受性，是機體抗缺氧或缺血的一種內源性保護現象。現已在心、肝、腎等臟器發現了低氧預適應現象，其中腦低氧預適應的研究備受關注。低氧預適應后腦中缺氧誘導因子1（HIF-1）的變化已有較多報道，但多集中于預適應的遲發效應。本研究著重于觀察短時間獲得預適應后HIF-1的變化。本實驗應用呂國蔚教授的整體水平低氧預適應模型，應用免疫組織化學（IHC）技術檢測低氧預適應小鼠腦組織中在HIF-1α蛋白質水平表達的變化，探討HIF-1活化對缺氧耐受的作用，為開展對腦缺血/缺氧研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 BSA（sigma），HIF-α兔多克隆抗體（Santa Cruz），生物素標記的羊抗兔IgG（中山生物公司），其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2 動物模型復制 選擇6～8周齡，體重18～22克的昆明種雄性小鼠有由內大動物室提供。按呂國蔚教授方法復制急性重復低氧預適應模型[1-2]。將小鼠置于含有新鮮空氣、經過標定約125ml的廣口瓶內，以橡皮塞密閉，記時、觀察，待小鼠出現喘呼吸，翻轉反射消失，立即取出，轉移至另一相同容積并含有新鮮空氣的廣口瓶內，密閉、記時，如此重復4次。實驗分3組：空白對照組(H0)、實驗對照組(H1)、低氧預適應組(H4)。

1.3 小鼠灌注 小鼠經低氧處理后按5ml/Kg體重，給小鼠腹腔注射6%的水合氯醛。將麻醉好的小鼠仰臥固定于臘盤上。灌注裝置管道清洗干凈，用0.01M PBS沖注排除氣泡。暴露胸和腹腔，沿胸骨劍突水平向兩側剪開皮膚至腋中線，然后向上剪至腋下，剪斷膈肌，掀開整個胸廓，打開心包，暴露心臟。沿腹中線向下暴露整個腹腔。在心尖即左心室部剪開一個小口，將灌注插管插入左心室至主動脈，固定插管。剪開右心耳，可見靜脈血流出。打開恒流灌注泵，灌注溫的（35℃～37℃）0.01M PBS緩沖液，將電壓開至10V，將血管內的血液全部沖干凈，當肝臟及虹膜全變白時，可暫停灌注，時間約為5分鐘，灌注量約為100ml。隨后再灌注4℃預冷的4%多聚甲醛固定液，速度宜先快后慢，開始電壓調為10V，當小鼠四肢、尾部出現抽動時即可將電壓調為5V，慢速注入固定液，時間約為10分鐘，灌注量約為150ml。灌注完畢后立即取小鼠完整全腦，放入4℃后固定液中進行后固定約8個小時。取出小鼠全腦置于20%蔗糖中進行置換。

1.4 切制免疫組織化學用腦片 待腦組織沉至瓶底表明置換完全，約12小時以上，隨后可進行冰凍切片。將樣品托盤嵌入冰凍切片機的插槽中，用滴管滴加水在托盤上作成冰臺，冰臺在切片機中平衡10分鐘，用切片刀將冰臺切修出一平整面。從20%蔗糖中取出腦組織，用刀片修整，再放入盛有異戊烷的塑料管中，浸入液氮中快速冷卻，10秒可取出塑料管中的腦組織，小心置于冰臺的平整面上，在組織周圍滴加水形成冰托以穩定組織塊。將樣品托盤安置并固定在樣品夾持臂上，調整切片刀和塑料擋板的位置，使組織塊快要接觸到刀口。連續切片，將組織切成厚度為40μm的腦片，置于PBS緩沖液中。腦片用PBS緩沖液洗3次，每次10分鐘可放置于4℃冰箱中備用。

1.5 免疫染色 將上述腦片置于PBST中3小時，再置于1%小牛血清（BSA）封閉液中，在室溫條件下封閉非特異抗原1小時，腦片用PBST洗3次，每次10分鐘。將腦片置于PBST稀釋的HIF-α兔多克隆抗體（1:500）中，室溫條件下在搖床上孵育16小時，將腦片和PBST稀釋的生物素標記的羊抗兔IgG二抗（1:300）室溫下共孵育2小時，隨后再和PBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素（Streptavidin）（1:300）在室溫下孵育1.5小時，PBST漂洗3次，每次10分鐘。將腦片置入新鮮配置的DAB顯色液中，顯色10分鐘。將腦片取出置于Tris-HCl (pH 7.6)緩沖液中終止顯色反應。將腦片裱貼在以明膠包被好的載玻片上，室溫晾干。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。由于HIF-α定位于細胞核和細胞漿，以出現棕黃色高出背景色為陽性細胞。

2 結果

正常對照（H0）組小鼠腦部可見HIF-α陽性染色，低氧一次（H1）組HIF-α染色與H0組相似，重復低氧（H4）組小鼠在大腦皮層、海馬CA1、3區錐體細胞層、分子層、多形細胞層、齒狀回處HIF-α陽性染色均上升。

圖1 低氧預適應小鼠腦HIF-1α的表達×15A:H0組， B:H1組, C:H4組，標尺：1mmFig.1. Expression of HIF-1αin brain of hypoxia preconditioned mice ×15 A:group H0, B：group H1, C：group H4, scale bar : 1mm

3 討論

HIF-1為異二聚體，由HIF-1α和HIF-1β組成，其中α亞單位為120kDa,穩定性受環境氧分壓調節，而β亞單位為91或94kDa,不受環境氧分壓影響，因而在某些方面，HIF-1α的變化就可以代表HIF-1的變化。在常氧狀態，腫瘤抑制蛋白pVHL結合在HIF-1α的ODDD區，通過泛素蛋白酶體系降解[3-4]。研究表明pVHL與HIF-1α結合的條件是HIF-1α的兩個脯氨酸（pro-402,pro-564）被羥化。羥化酶需要分子氧和Fe2＋以及抗壞血酸存在[5-6]。因此低氧或者Fe2＋的拮抗劑及類似物（Co2＋等）都能穩定HIF-1α。HIF-1α穩定積累后進入細胞核中，與HIF-1β形成異二聚體并與其它的轉錄調節因子一起調節含有缺氧應答元件的基因。

我們先前研究顯示，急性重復低氧可以增加小鼠海馬HIF-1α蛋白的表達和HIF-1的DNA結合[7]。HIF-1的腦保護主要是通過HIF-1靶基因的表達來實現的，其中VEGF和EPO是明確的具有腦保護作用的HIF-1的靶基因。兩個分子的腦保護作用主要表現在降低腦梗死體積，通過上調抗凋亡基因Bcl-xL實現的[8]。除了明確的具有腦保護作用的HIF-1的靶基因，其他的潛在的具有腦保護的HIF-1的靶分子在抗腦低氧/缺血中也有重要作用[2-9]。在眾多的HIF-1調節的基因的作用下，神經細胞得到了保護，維持了其基本功能及高級功能[10-11]。

我們的研究顯示，低氧預適應可以在小鼠的大腦皮層、海馬腦區及其他部位誘導HIF-1的表達。HIF-1在低氧預適應中處于關鍵位置，而大腦皮層和海馬在維持腦功能中的作用是非常重要的。因此預適應誘導小鼠大腦皮層和海馬各區HIF-1的表達，可能是腦保護形成的關鍵步驟。由于我們使用的免疫組織化學的方法研究的蛋白表達變化，其準確性不高。如果輔助以激光顯微切割技術，則可以精確研究腦部各部位細胞的HIF-1表達變化情況。

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