布-加綜合征與F V Leiden及FIIG20210A突變關系探究

朱子清 李勝利 嚴文君 孫桂香 祖茂衡 陸召軍

布加氏綜合征（Budd-Chiari syndrome,BCS）是由多種原因引起的肝靜脈或肝段下腔靜脈部分或完全梗阻性肝靜脈-下腔靜脈血液回流障礙，導致瘀血性門靜脈高壓癥和下腔靜脈高壓癥兩大綜合征。它是以肝小靜脈及下腔靜脈與右心房靜脈交匯處各段狹窄或阻塞而致肝靜脈血流受阻失調為特征的總稱。BCS可見于任何年齡，以青壯年和中老年多見，綜合國內近20年來發表的文獻BCS患者已經超過萬余例[2]，居世界首位。該病在西方國家被認為主要是由血液的凝血系統及抗凝系統紊亂導致的血栓引起，有幾種可能機制如凝血V因子Leiden突變、蛋白C缺乏、凝血酶原(FII)基因G20210A突變、抗凝血酶Ⅲ缺乏等。我們從國外多個研究中心最新的數據可以看出，原發性的BCS被認為是一種多病因導致的疾病，許多促凝因子的失調導致在這一極為不常見的位置形成血栓。在至少35%的患者中觀察到其血栓形成率要比普通人群高[3]。本次研究從導致凝血機制和抗凝機制紊亂的基因層面—FV Leiden與FIIG20210A基因突變角度著手研究，現將研究結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集徐州醫學院附屬醫院2008年10月～2010年7月在介入科住院治療的布加綜合征患者102例為研究對象，其中，男性58例（56.86%），女性44例（43.14%）；患者年齡18～67歲，平均46歲。所有患者均于治療前抽取外周靜脈血2ml。

1.2 入選標準

所有病例均首選彩色多普勒超聲作為篩查手段，而后采用金標準下腔靜脈造影（Seldinger法）或肝靜脈造影及手術確診為布加綜合征。排除外傷致急性BCS患者、入院前因BCS出血而輸血者及BCS合并肝癌者。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取及保存

抽取病例組及對照組肘正中靜脈血2ml于真空采血管（EDTA-K2抗凝）中，-80oC超低溫冰箱保存。應用全血DNA提取試劑盒對外周血進行DNA的提取（試劑盒由上海賽百盛基因技術有限公司生產），對提取后的DNA進行純化。

1.3.2 AS-PCR 檢測F V Leiden與FIIG20210A兩個點突變

引物設計：FV Leiden和FIIG20210A基因在GeneBank中的序列號分別為HGNC:3542和HGNC:3535。參照文獻[4]設計引物，包括一對外側引物(forward primer，reverse prime)以擴增出基因第十外顯子，即為體系驗證引物內參，另外兩條(specific primer)為特異突變點引物，兩條特異性引物分別同內參引物組成反應體系進行AS-PCR。

表1 31物與對應序列

反應體系如下：取一0.2 mlPCR管，按下列次序加入以下物質：DNA模板100ng，forward primer 1μl，reverse primer 1μl，specific primer 1μl，10*PCR緩沖液(含MgCl2)5μl，dNTP5μl，5U/μl Taq酶1μl，補足去離子水31μl至總反應體積為50μl。

混勻管內混合物，滴入20～40 μl礦物油覆蓋表面。將上述反應管放入PCR儀，按下列參數進行循環(the Hybaid Touch Down PCR assay,TD PCR): 94℃變性2min，1cycle；94℃變性20 s，66℃退火40 s，66℃延伸40 s，10cycles, 94℃變性20 s，62℃退火20 s，72℃延伸20s，20cycles；延伸72℃，2min。

反應完畢取出反應管，取出5ul樣品進行瓊脂糖電泳（1.5%濃度,EB染色）以鑒定片段大小,內對照為429bp，若存在陽性突變則特異突變點FV Leiden和FIIG20210A將會分別產生為234bp和145bp條帶，將電泳后的凝膠進行成像處理。

2 結果

本次研究中的BCS病例組阻塞類型以下腔靜脈型為主，占69.2%，混合型占24.62%，而肝靜脈型最少，占13.8%，且以膜性阻塞為多數。與國內外已知研究結果相一致。提取的DNA經核酸蛋白檢測儀測定，濃度值范圍在(25.5773～59.2843)ug/ml區間，其吸光度OD260/OD280 值（即純度值）范圍在 1.5731～1.9653區間，符合AS-PCR的要求。經AS-PCR檢測，102例BCS FV Leiden與FIIG20210A兩位點，經瓊脂糖凝膠電泳顯示均為陰性，見圖1。

圖1 Factor V Leiden與FIIG20210A位點電泳圖

3 討論

AS-PCR又稱為擴增阻滯突變系統(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)通過設計寡核苷酸引物，使得這一引物僅僅與突變點相匹配而在PCR過程中擴增。ASPCR最大的優點是靈敏度高，其檢測范圍可達1%～3%。Jones等的實驗也表明ARMS方法能夠檢測出其中只有1%～2%比例的突變點[5]。現在西方國家的許多實驗室（如ARUP, Salt Lake City, UT; Oregon Medical Laboratories, Eugene, OR;and Rush Medical Laboratories, Chica-go,IL）都把以ASPCR方法為基礎的檢測用于臨床檢驗目的。AS-PCR在目前可謂是一種簡便可靠的基因檢測方法。

由于凝血因子V(Factor V,FV)基因點突變（FV Leiden）所致的蛋白C（Protein C,PC）抗凝途徑中抗活化的蛋白C（Activated Protein C Resistance,APCR）現象是引起靜脈血栓（Venous Thrombosis,VT）的主要原因，但FV Leiden 突變的發生率在不同種族的人群中存在明顯差異，在歐洲白種人群中具有高發性。凝血酶原(FII)是一種在肝細胞中合成的維生素K依賴性蛋白質，其水平高于1.15U/ml者較正常者血栓形成危險增加2.1倍[6]。Poort等[7]研究發現，FII基因G20210A突變和FII 水平升高有顯著相關性，該點發生突變可使靜脈血栓形成危險性增加3倍。以上兩種點突變發生時，均致使靜脈內凝血機制發生異常，易形成BCS。西方國家有關這兩種點突變致BCS有大量報道，由此認為，FV Leiden突變產生的APC 阻抑是BCS 發病的基本病因；而對于FIIG20210A突變致BCS發病的危險性有一定增加但并不非常顯著，多個血栓形成高危因子并存時可使其發病率增高，這也說明BCS發病可能是不同的發病機制綜合作用的結果。我國已有對散發性BCS進行以上兩點檢測的報道，均未發現存在點突變，但馮博等[8]發現6例家族性患者中有4例FV Leiden雜合型突變。結合國外的研究，在大多數的正常高加索人群中FV Leiden及FIIG20210A突變的頻率分別為6%和2%左右[9]，而國內對此課題的研究并沒有發現散發性BCS患者人群中存在兩個位點的點突變[10]，在一定程度上表明FIIG20210A突變存在種族和地理分布的差異。此次研究我們采用了不同于國內其他課題組的基因檢測方法，但結果相似，未在散發性的BCS人群中檢測出此兩點點突變，再次提示我國BCS的發病可能與這兩個點突變沒有關聯。

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