低滲造影劑對老年糖尿病大鼠腎毒性的研究

王瑞強 王毅 李濤 劉闖 蒲娟娟 于潔

隨著現代醫學影像診斷和介入治療的快速發展，血管內造影劑的應用越來越普及，造影劑腎病(contrast induced nephropathy，CIN)的發病率也呈上升趨勢。造影劑腎病是指血管內注射碘造影劑后48 h內，在排除其他病因的前提下，腎功能發生損害，血清肌酐水平升高0.5 mg/dl(44.2 μmol/L)或比基礎值升高25%以上。由造影劑引起的急性腎功能衰竭是醫院獲得性腎功能衰竭的常見原因，居于醫院內獲得性腎衰竭第3位［1］。既往無腎臟疾病的患者，其CIN發病率為3.35%～8%，平均5%，而對于患有糖尿病或腎臟疾病者，CIN發病率則明顯上升高達50%［2］。老年患者由于腎小球硬化、腎血流量減少等因素的影響，在應用造影劑時更容易產生一系列不良反應［3］。

糖尿病人群中CIN的發病機制尚未完全明確，氧化應激以及信號傳導是目前研究的熱點。本研究通過制作老年糖尿病大鼠模型，觀察低滲造影劑對腎功能和腎組織一氧化氮(NO)及谷胱甘肽(GSH)的影響，并探討NO及GSH在CIN中的作用，從而進一步揭示CIN的發病機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 SD大鼠，6～7月齡雄性，體質量420～520 g，清潔級，40只，隨機取出10只作為正常對照組(SD組，n=10)，其余給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ Sigma公司)60 mg/kg(STZ用0.1 mmol/L，pH4.5的枸櫞酸鈉緩沖液配制成2%溶液)，正常對照組給予腹腔注射等體積枸櫞酸鈉緩沖液。注射72 h后尾靜脈取血檢測血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上者表示老年糖尿病大鼠造模成功。大鼠飼養期間每周檢測空腹尾靜脈血血糖1次，根據血糖情況每天給予中效人基因重組胰島素1～2 U，早晨一次性皮下注射，維持空腹血糖在16～26 mmol/L之間。每間隔2周測量1次體重。

8周后，26只老年糖尿病大鼠造模成功。老年糖尿病大鼠隨機分成2組:糖尿病對照組(DM組，n=13);糖尿病+低滲造影劑組(LOCM組，n=13)。LOCM組經尾靜脈注入歐乃派克350(10 ml/kg);DM組和SD組經尾靜脈注入生理鹽水(10 ml/kg)。注射2 d后處死大鼠，處死當天在1%戊巴比妥麻醉下行心臟穿刺收集血標本、腎臟標本。

1.2 檢驗項目與方法 血肌酐、尿素氮、血糖由全自動生化分析儀完成。

取出大鼠腎臟組織，分離出部分腎皮質，加入冰冷生理鹽水制成10%組織勻漿，低溫離心機離心，取上清液，測定GSH含量及NO水平(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)，嚴格按照試劑盒說明操作。

2 結果

2.1 一般情況的變化 實驗期間，正常對照組大鼠體重明顯增加，精神狀態良好，反應靈敏，動作敏捷，毛色光澤，無一只死亡。糖尿病大鼠出現多飲、多食、多尿、消瘦、精神萎靡、反應遲鈍、毛無光澤，四只死亡。

2.2 腎功、血糖的變化 造模成功后，糖尿病大鼠血糖水平即明顯高于正常對照組，并維持高水平至實驗結束。LOCM組、DM組與SD組相比，血肌酐和尿素氮升高明顯，差異有統計學意義。LOCM組與DM比較血肌酐、尿素氮升高，差異無統計學意義(見表1)。

2.3 腎臟組織勻漿一氧化氮、谷胱甘肽的變化 DM組與SD組比較，一氧化氮、谷胱甘肽降低，差異有統計學意義。應用造影劑后，LOCM組與DM組比較一氧化氮降低更明顯，差異有統計學意義(見表2)。

表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮和血糖水平比較()

表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮和血糖水平比較()

注:與正常對照組比較，*P＜0.01，■P＜0.05

組別 例數(只) BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) BS(mmol/L)正常對照組10 5.44±1.32 46.80±9.06 5.75±0.58糖尿病對照組 13 7.71±1.21■ 56.15±9.49■ 23.36±6.62*糖尿病+低滲造影劑組 13 8.23±1.18■ 61.31±11.11* 24.93±7.52*

表2 各組大鼠一氧化氮、比較()

表2 各組大鼠一氧化氮、比較()

注:與正常對照組比較，*P＜0.01，■P＜0.05;與糖尿病對照比較，▲P＜0.05

組別 例數(只) NO(μmol/mg pro) gsh(μmol/g pro)正常對照組10 0.31±0.05 2.23±0.16糖尿病對照組 13 0.24±0.04* 2.04±0.24■糖尿病+低滲造影劑 13 0.15±0.05＊▲ 1.92±0.21*

3 討論

糖尿病人群CIN的發病機制尚未完全明確，目前認為可能是多機制參與的，主要的發病機制有血流動力學改變導致腎臟缺氧性損傷、造影劑的腎毒性效應以及氧化應激等。臨床上使用的造影劑分為離子型高滲、離子型和非離子型等滲與低滲造影劑。多數學者認為低滲、等滲造影劑的安全性優于高滲造影劑［4］。本試驗選用的是在臨床廣泛應用的低滲造影劑。本研究發現糖尿病+低滲造影劑組與糖尿病對照組比較血肌酐、尿素氮升高不明顯，但是與正常對照組比較升高明顯，可能與我們選用的低滲造影劑低腎毒性有關。

活性氧(ROS)損傷作用越來越受到重視。ROS含量超過抗氧化劑含量時，常發生氧化應激反應，而且ROS作為細胞外信號分子，參與血管收縮活動。氧化應激也被認為與糖尿病的發病以及糖尿病并發癥的快速進展相關［5］。有文獻指出糖尿病患者本身的抗氧化能力(如谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及維生素C，E，A等)已經降低［6］。而且糖尿病人群常同時伴有高血壓、代謝障礙、多支冠狀動脈病變等其他危險因素，可能也與該人群CIN高發病率相關。由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合而成的谷胱甘肽(GSH)被認為是復雜的抗氧化網絡的中心，其半胱氨酸上的巰基為其活性基團，可以直接清除氧自由基發揮抗氧化作用［7］。但是谷胱甘肽水平隨著年齡增長而降低，從而老年人容易受到氧化應激的威脅［8］。本實驗發現老年糖尿病大鼠的GSH水平下降，應用造影劑后與糖尿病對照組大鼠比較GSH水平輕微下降。老年糖尿病大鼠的低GSH水平，可能使其更易受到造影劑的損害。

腎臟血管收縮因子(包括腎素一血管緊張素一醛固酮系統、內皮素、腺苷、鈣離子等)和舒張因子(一氧化氮和前列腺素等)比例失調導致血流動力學改變與CIN密切相關。生物體內NO主要由一氧化氮合成酶以左旋精氨酸為底物，在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，黃素單核苷酸(FMN)，四氫生物蝶呤(H4B)等因子輔助下生成。生物體內NO通過擴散或其它方式傳輸到鄰近細胞，結合并活化可溶性血紅素蛋白鳥苷酸環化酶，生成環磷酸鳥苷，參與多種信號途徑。NO作為信使和細胞因子參與血壓調節、神經信息傳遞及抗感染防御等重要功能［9］。本研究發現糖尿病大鼠模型建立8周后，NO含量顯著低于正常對照組，應用造影劑后NO水平進一步下降。老年糖尿病大鼠已經存在NO代謝障礙，推測低滲造影劑進一步削弱了NO的合成或加速了NO的消耗，繼而出現持久的腎內血管收縮，導致腎臟缺血、缺氧，損傷腎小管，腎小球濾過率下降，加重腎功能損害。低滲造影劑影響NO的機制尚不明確，低滲造影劑是否影響到一氧化氮合成酶的合成，以及如何干預一氧化氮合成酶的功能(例如是否影響到是否影響到一氧化氮合成酶的電子傳遞，以及一氧化氮合成酶的空間構型是否改變)是我們團隊目前的研究內容。

綜上所述，低滲造影劑可以引起糖尿病大鼠腎功能的減退，這可能與其影響NO的代謝有關，這為我們今后進一步的研究指明方向。

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