萊菔子中芥子堿硫氰酸鹽提取工藝的優(yōu)化

楊映霞 孟多佳 孫玉濱 于偉華 奚東玲

萊菔子為十字花科植物蘿卜Raphanus sativus L的干燥成熟種子。其主要功效是消食除脹、降氣化痰［1］。萊菔子中主含萊菔素(Raphanin)，芥子堿(Sinapine)，芥酸(erucicacia)，亞油酸，植物甾醇等。其中，芥子堿是其降壓作用的活性成分之一。實(shí)驗(yàn)表明，萊菔子中芥子堿多以芥子堿硫氰酸鹽(Sinapinethiocyanate)的形式存在［2］。因此，測(cè)定芥子堿硫氰酸鹽的含量對(duì)于控制藥材質(zhì)量和制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定具有較重要的意義。筆者在參考有關(guān)文獻(xiàn)［3-4］的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 一般材料 島津10ATvp高效液相色譜系統(tǒng)(二元泵 柱溫箱AT-330，檢測(cè)器SPD-10ATvp，浙江大學(xué)N-2000色譜工作站LC-10ATvp)、超聲波清洗器(型號(hào)KH-250，功率250 W，工作頻率50 Hz，昆山禾創(chuàng)超生儀器有限公司)。

1.2 試藥 萊菔子藥材購(gòu)自長(zhǎng)春市藥材公司，經(jīng)鑒定為正品;芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品(111702-200501中國(guó)生物制品所鑒定所);水為哇哈哈純凈水;乙腈為色譜純;其他均為分析純。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.3 正交試驗(yàn) 以芥子堿硫氰酸鹽作為考察指標(biāo)，對(duì)萊菔子提取和干燥過(guò)程中影響較大的加水量(A)溶劑PH(B)干燥溫度(C)提取次數(shù)(D)4個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)。(表1)

1.4 芥子堿硫氰酸鹽含量測(cè)定［4］

1.4.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX XDB C18(4.6 mm×250.0 mm，5 μm);乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 ml加十二烷基磺酸鈉0.1 g)(32∶68)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm;柱溫30℃;理論塔板數(shù)不低于5000;進(jìn)樣量5 μl。

1.4.2 對(duì)照品溶液制備 取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1 ml含10.08 μg的溶液。

1.4.3 供試品溶液制備 取正交試驗(yàn)樣品6 g，研細(xì)，取0.5008 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超生處理30 min，放冷;用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5 ml，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液;即得。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取濃度為10.08 ug/ml的對(duì)照品溶液2、5、7、10、12 ul注入液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖，測(cè)定其峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，芥子堿硫氰酸鹽濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程:Y=12546 X+361.49，r=0.9999 。結(jié)果表明，在0.02 ～0.12 ng/ml時(shí)，芥子堿硫氰酸鹽濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 按正交設(shè)計(jì)L9(34)提取藥材，合并濾液，濃縮醇沉。減壓干燥，粉碎，得正交試驗(yàn)樣品粉末，按“1.4.4”測(cè)定樣品中芥子堿硫氰酸鹽的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，各因素對(duì)芥子堿硫氰酸鹽提取影響大小為B＞C＞D＞A最佳提取工藝為B2C1D2A3即取藥材加溶劑pH值為5.5，浸膏干燥溫度60℃，提取3次;藥材為10倍量水，干膏粉碎即得。方差分析表明，B、C因素對(duì)芥子堿硫氰酸鹽影響顯著(P＜0.05)，D、A因素在考察范圍內(nèi)影響較小，無(wú)顯著性影響，考慮到生產(chǎn)成本問(wèn)題優(yōu)選工藝為B2C1D2A1。

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由于優(yōu)選的工藝未包括在正交設(shè)計(jì)表的9次試驗(yàn)中，故對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。用同一批藥材按照前述的提取干燥過(guò)程，按B2C1D2A1工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)3次，結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可知此工藝基本穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 芥子堿是萊菔子中降壓作用的有效成分，在許多以萊菔子為君藥的中藥制劑中，均采用芥子堿硫氰酸鹽作為主要考察指標(biāo)，同時(shí)對(duì)控制藥材質(zhì)量也有一定的意義。故該試驗(yàn)也選用芥子堿硫氰酸鹽作為提取工藝篩選的優(yōu)化指標(biāo)。

3.2 在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)芥子堿硫氰酸鹽在室溫光照條件下，穩(wěn)定性較差，易被破壞。因此，應(yīng)盡可能的在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定，以免試劑分解影響結(jié)果。

3.3 本實(shí)驗(yàn)采用水作為生產(chǎn)提取溶劑，優(yōu)化提取工藝，價(jià)格便宜，方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便安全，適合應(yīng)用于工業(yè)化。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:256.

［2］劉麗芳，王宇新，張新勇，等.萊菔子中芥子堿的含量測(cè)定.中成藥，2002，(2):52.

［3］丁臻，蔡梅超，周洪雷，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選萊菔子水溶性生物堿提取工藝.食品與藥品，2011，13(1):19-21.

［4］譚鵬，姜虹玉，呂文海.萊菔子研究概況.實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2005，21(4):254-255.