人工免疫組化的注意事項及影響因素

李建國 陳善紅

免疫組織化學(IHC)是在1941年由微生物學家AH Coons起步的，在1976年Melistain及Kohler發明單克隆抗體技術以來得到了極大的發展。我國自1980年在國內逐步開展以來，至今已普遍應用于各級醫院的病理診斷中，不僅在部分疑難病例的診斷與鑒別診斷中起著決定性的作用，而且對臨床的介入越發深入，在腫瘤的預后判斷、臨床處理、治療反應尤其是靶向治療方面發揮著不可替代的重大作用。我院自上世紀九十年代開展人工免疫組化技術以來，至今已完成3000余例。現將我院在人工免疫組化工作當中的心得體會與大家做一探討。

1 免疫組化實驗原理與過程

免疫組化繼承了組織化學用顏色代表化學成分的傳統，全過程包括:首先從已知組織細胞中提取出抗原，然后通過免疫動物獲得特異性抗體，繼而把純化的抗體標記上示蹤劑(可用熒光劑或過氧化物酶)，最后一步則是把標記的抗體與欲檢測的組織反應(染色)。免疫組化反應的位置抗原在細胞膜、細胞漿、細胞核甚至是在某一個細胞器上，有明確的定位，因而假如組織細胞某個部位出現抗體所帶的染色，那就表明該處是抗體所在部位，也就是抗原所在的位置，從而證明所檢測的組織細胞中有相關的化學成分，因而可以定性檢測細胞內各種微生物、蛋白、多糖、核酸甚至DNA、RNA基因表達產物，在一定程度上可以說明組織細胞的代謝途徑和功能作用。因而免疫組化是以形態學為主，形態、代謝、功能相結合的三位一體的科學［1］。

1.1 組織的處理 免疫組化反應抗原的準確顯示與定位制備的組織細胞標本質量的好壞密切相關。組織固定應及時充分，及時的固定不僅可使細胞內蛋白凝固，終止外/內源性酶活性，并可最大限度地保存組織細胞的形態結構和抗原性，使水溶性抗原轉變為非水溶性抗原，防止抗原彌散。大塊組織應及時平行多刀剖開固定，時間以12～24 h為宜，固定劑首選10%中性福爾馬林，組織塊應選取新鮮無出血壞死并有代表性者，不宜過大過厚，必須小于2 cm×1.5 cm×0.3 cm，厚度≤0.3 cm，微小組織和液體沉淀物先用濾紙妥為包裹后固定。固定液體積一般大于組織20倍以上。

1.2 防脫玻片的處理 以前應用普通載玻片清洗后涂以多聚-L-賴氨酸防脫劑自己制作防脫片，現在國內病理科內已普遍應用免疫組化專用的商業防脫黏膠載玻片，質量穩定，開盒即用，已無需再處理。

1.3 包埋與切片 過熱的石蠟液包埋容易破壞潰瘍，宜選用低熔點的石蠟(熔點＜60℃)。切片厚度需在3～5 μm，宜薄不宜厚，過厚的切片不僅影響免疫反應，而且影響鏡下觀察。

1.4 抗原修復(AR) 組織細胞經福爾馬林固定后，抗原結構的理化性質發生顯著改變，表位空間結構改變導致許多抗原活性消失。通過一定的方法可以使組織抗原表位再次充分暴露，重現抗原的原有活性。目前，加熱修復抗原是絕大多數抗原最有效的修復方法，但少數抗原需采用酶消化法。加熱修復方法主要包括:高壓法、微波法、水溶法等，實驗顯示修復效果為高壓法＞水溶法＞微波法。需注意的是沒有一種抗原修復液能適用于所有的抗體，因此需根據抗體選用合適的抗原修復液。

1.5 內源性生物素的封閉 在免疫組化中若采用過氧化物酶檢測系統，必須滅活過氧化物酶，否則組織中的紅細胞、粒細胞可能會干擾染色結果的判斷。一般采用3%H2O2封閉效果比較顯著，有時也在加一抗之前實驗封閉血清，選擇的血清種屬一般與二抗的種屬相同，以減少非特異性顯色。一抗中若含有正常血清可免去此步驟。

1.6 沖洗 用于除去組織中的AR液、未被特異性結合的一抗和二抗并調節組織細胞的pH環境。要求在操作中應嚴格遵守實驗沖洗步驟，動作輕緩，水流不得直對組織以防止脫片;沖洗次數與時間應足夠。

1.7 滴加試劑及孵育事項 包括滴加一抗、二抗與顯色劑。輕輕傾去液，用濾紙吸干組織周圍液體，輕輕蘸取組織表面水分(但絕對不能擦);滴加試劑量要適中，把火柴桿尾端壓片并展開，用之將試劑輕輕攤開至組織外1～2 mm，液面厚1 mm左右，注意操作過程中不能碰到組織，若有氣泡可直接刺破或點走以免出現氣泡下假陰性反應。抗體孵育的溫度以25℃ ±8℃為準，時間約為30～60 min，。抗體孵育應在潮濕封閉的環境中進行，避免抗體試劑水分蒸發造成抗體濃縮干燥致使全片著色，因此高質量的孵育盒是免疫組化的必要實驗用品。需要注意的是試劑的濃度、孵育溫度和孵育時間是相互關聯的，濃度與溫度和時間基本成反比，即孵育濃度越高，孵育溫度就應該越低，孵育時間就應該越短，反之亦然。試劑英避免長時間置于室溫中，盡量減少溶凍次數，防止效價下降。

1.8 顯色 DAB(棕色)顯色劑應現配現用，30 min內用完。若切片量大時英分次配制分批顯色。顯色時間3～5 min，可根據溫度和切片整體顯色情況決定顯色時間。一般顯色時間過長會出現顯色過深或背景著色，時間過短則會出現顯色過淺或假陰性;尤其對部分需要定量報告的抗體如Ki-67、PR、ER、Her-2等更需細心觀察，逐一適時終止反應。

2 影響免疫組化染色的常見因素

2.1 組織損傷 如機械損傷、電烙手術損傷、組織變干，無論是組織固定欠佳還是染色過程中試劑覆蓋組織欠佳，皆會導致組織變干后蛋白變性，抗原性喪失，表現為無色片或全片著色。

2.2 組織固定不理想 組織固定的好壞直接與抗原的保存有關，組織固定不及時，固定液的種類和濃度不恰當，固定時間過短過長皆會影響染色效果。

2.3 組織處理不當 在組織脫水、浸蠟、包埋、烤片過程中時間過長會導致抗原丟失。掌握的原則是:在石蠟能夠熔化的前提下，溫度越低抗原保存越好，而烤片溫度常規在60℃，時間為1 h。

2.4 抗原修復不足 目前免疫組化染色結果不佳的主要原因是抗原修復不足。目前常用的高壓鍋法，應在噴氣后再維持1.5～2 min。

2.5 抗體試劑質量問題 目前各公司生產的抗體一般都能保證產品質量，但由于運輸、分裝、儲存等環節皆會影響產品質量，因此買回抗體后應進行測試確認不存在質量問題。

2.6 染色技術問題 免疫組化染色步驟繁多，任何一步出問題都會導致染色失敗，而且染色效果與室溫密切相關，因此操作者不僅應具有很強的責任心，而且在實際工作中應根據各實驗室具體情況摸索出一套適合自己的工作規程。

［1］周會芹，楊江輝，余琦，等.不同組織固定液對免疫組化結果的影響.診斷病理學雜志，2009，16(6):478.