苦蕎類異黃酮還原酶基因(FtIRL)的克隆及序列分析

趙海霞，李成磊，白悅辰，陳 惠，吳 琦*

(四川農業大學生命科學與理學院，四川 雅安 625014)

苦蕎類異黃酮還原酶基因(FtIRL)的克隆及序列分析

趙海霞，李成磊，白悅辰，陳 惠，吳 琦*

(四川農業大學生命科學與理學院，四川 雅安 625014)

利用RT-PCR技術，從苦蕎(Fagopyrum tatarium)中克隆得到類異黃酮還原酶基因(IRL)的開放閱讀框序列(ORF)，命名為FtIRL。序列分析表明：FtIRL含一個長942bp的ORF，編碼313個氨基酸，其氨基酸序列與金蕎異黃酮還原酶FcIFR (GenBank登錄號ABV02071)同源性最高，達到97%；與其他植物IRL同源性為44%～73%。生物信息學分析表明：FtIRL推導的蛋白質含有典型的底物結合口袋和保守的NADPH結合位點，符合短鏈脫氫酶家族的結構特征。構建基于氨基酸的系統發育樹表明，苦蕎FcIFR雖然在氨基酸序列上與其他植物的異黃酮還原酶(IFR)有較高的同源性，但其生物學功能可能更接近落葉松脂醇還原酶(PLR)。

苦蕎；類異黃酮還原酶；基因克隆；序列分析

苦蕎(Fagopyrum tatarium)也稱韃靼蕎麥，屬蓼科植物，原產于我國及印度等地，在我國主要分布在西南山區、云貴高原及陜西和山西等地。隨著經濟和科學的發展，以及對苦蕎營養價值和保健功能的深入研究，對苦蕎的利用和開發也越來越受到重視[1]。祖國醫學《本草綱目》記載，苦蕎性味苦、平寒，有益氣力、續精神、利耳目和降氣寬腸健胃的作用。現代臨床醫學表明，食用苦蕎及其制品可顯著降低人體血液中的膽固醇和血糖含量，對高血壓、冠心病和中風等病人都有輔助療效作用，對糖尿病有良好的治療和緩解作用。這些作用都與苦蕎中富含的黃酮類物質有關[2]。

異黃酮還原酶(isoflavone reductase，IFR)、落葉松脂醇還原酶(pinoresinol-lariciresinol reductases，PLR)和苯基香豆滿芐醚還原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase，PCBER)是合成木質素(lignans)和異黃酮(isoflavone)等植物次生代謝產物的關鍵酶，是具有NADPH依賴性的芳香族還原酶[3]，屬于同源性較高的短鏈脫氫酶家族(short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)成員[4]。由于對IFR、PLR和PCBER各成員生物學功能和反應機制的了解還比較有限，學界將其統一稱為類異黃酮還原酶(isoflavone reductase-like，IRL)[5-6]。近年來的研究發現，IRL參與了植物對生物和非生物脅迫的應答[7]，與植物中多種抗毒素的合成密切相關，例如紫花苜蓿(Medicago sativa)中MsIFR是合成美迪紫檀素(medicarpin)的關鍵酶[8]。本研究以苦蕎為材料，克隆編碼苦蕎IRL的cDNA序列，為進一步研究苦蕎黃酮類化合物的合成表達調控與其抗逆生理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎：“西蕎二號”購自四川西昌學院。

Taq DNA聚合酶、質粒DNA小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、克隆載體pMD19-T 日本TaKaRa公司；RNA提取試劑植物RNAout試劑盒 天澤基因工程有限公司；逆轉錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 加拿大Fermentas公司；其他化學試劑均為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

苦蕎花蕾總RNA提取所需器皿均按RNA操作常規方法處理。以植物RNAout試劑盒提取苦蕎花蕾總RNA，電泳檢驗其完整性并置于液氮中保存。

1.2.2 RT-PCR制備cDNA第一鏈

依次向200μL PCR管中加入苦蕎花總RNA 4μL、引物Oligo-dT (10μmol/L) 1μL、DEPC H2O 7μL，溫和混勻后，70℃變性5min，立即置于冰上。向上述PCR管中加入5×Reaction Buffer 4μL、RiboLockTMRiobonuclease Inhibitor 1μL、dNTP Mix (10mmol/L) 2μL，37℃反應5min除去可能的RNA酶污染。上述PCR管中加入1μL RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase，反應總體積20μL。42℃反應 60min；70℃條件下10min滅活反轉錄酶，將合成的cDNA第一鏈保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3 苦蕎IRL基因開放閱讀框序列(ORF)的克隆

根據NCBI上已經發表的金蕎(Fagopyrum cymosum)異黃酮還原酶基因序列(GenBank登錄號EU116032)設計一對特異引物IRL-f和IRL-r。上游引物IRL-f包含基因的起始密碼ATG，序列為：5＇-GATGGCAAAGGGCAAGG TG-3＇(下劃線為起始密碼)；下游引物IRL-r位于基因的3＇AUTR區域，序列為：5＇-GCTCGCTCAAGAAAGGGGT-3＇。

苦蕎類異黃酮還原酶基因cDNA的PCR反應體系：ddH2O 34μL、10×Buffer 5μL、25mmol/L MgCl23μL、dNTP mixture 3μL、20μmol/L上下游引物各1.5μL、模板cDNA 1μL、Taq DNA聚合酶1μL (5U/μL)，總體積50μL。PCR反應參數：94℃預變性3min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸150s，共30個循環；72℃保溫8min。利用膠回收試劑盒回收PCR擴增片段并克隆到pMD 19-T載體，篩選陽性轉化子送上海英駿生物技術公司測序。

1.2.4 苦蕎IRL的生物信息學分析

測序結果采用http://genes.mit.edu/GENSCAN.html和http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgic進行序列比對分析。采用http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/預測蛋白質二級結構，http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/和http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/預測信號肽序列和亞細胞定位。采用SWISSS MODEL (http:// swissmodel.expasy.org/)進行蛋白質結構三維建模。采用用軟件MEGA 4.0構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 苦蕎花總RNA的提取及其IRL基因ORF的擴增

圖1 苦蕎花總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis of total RNA extracted from F. tataricum

圖2 苦蕎IRL基因ORF的擴增Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified products of IRL ORF from F. tataricum

由圖1苦蕎花總RNA經2%瓊脂糖凝膠電泳可知，28S RNA和18S RNA的條帶清晰可見，亮度比接近2:1，RNA完整性較好。以反轉錄后的cDNA為模板，使用引物IRL-f和IRL-r進行PCR擴增。由圖2可知，擴增得到一條約1.2kb的特異條帶。

2.2 FtIRL的序列分析

PCR擴增產物經克隆并測序后，得到長度為1081bp的核苷酸序列，包含引物設計位點IRL-f和IRL-r，將該序列命名為FtIRL。http://genes.mit.edu/GENSCAN.html網站預測結果表明，FtIRL包含1個長度為942bp的完整ORF，編碼313個氨基酸；含有植物黃酮類化合物合成相關基因典型起始序列ATGGCA[9]；終止密碼TAG后含有一段138bp的3＇-UTR。將FtIRL推導的氨基酸序列提交http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgic進行同源比對，結果表明FtIRL的氨基酸序列與FcIFR(GenBank登錄號ABV02071)同源性最高，達到97%；與其他植物IRL同源性為44%～73%之間，表明成功克隆苦蕎FtIRL的cDNA序列。

將FtIRL的氨基酸序列提交應用蛋白質組分析工具(http://www.expasy.org/tools/#proteome)，推測FtIRL蛋白總的原子數為5008個，理論分子質量為35.23kD，pI值為6.20；蛋白質中極性氨基酸含量為33.55%，疏水氨基酸含量為 36.10%。采用SignalP 3.0 (http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/)對 FtIRL蛋白進行亞細胞定位預測，沒有發現分泌途徑信號肽(S P)、葉綠體轉運肽(cTP)以及線粒體靶肽(mTP)，表明FtIRL蛋白可能定位于細胞質[10]。

圖3 FtIRL的ORF序列及其對應的氨基酸序列Fig.3 DNA sequence of ORF of FtIRL gene and deduced amino acid sequence of FtIRL protein

2.3 FtIRL二級結構分析

采用SOPMA(self-optimized prediction method from alignment)程序進行FtIRL蛋白二級結構預測。由圖4可知，FtIRL蛋白二級結構較為復雜，其中α-螺旋占39.30% (12個較大的α-螺旋，6個較小的α-螺旋)，β-折疊為17.25%(14個β-折疊)，β-轉角為9.27%(15個β-轉角)以及34.19%的無規則卷曲。FtIRL蛋白的二級結構與紫花苜蓿MsIFR和金葉連翹FiPLR蛋白的高度相似，三者在二級結構單元的含量和部位上差異較小，為其形成活性中心和行使相應的生物學功能提供了良好的結構基礎。

圖4 FtIRL二級結構預測Fig.4 Deduced secondary structure of FtIRL protein

2.4 FtIRL三維結構建模

圖5 FtIRL蛋白的三級結構Fig.5 Deduced 3-D structure of FtIRL protein

進入Swiss-Model三維結構預測服務器，將所得PDB文件用Spdbv37sp5軟件進行瀏覽和編輯，見圖5。FtIRL蛋白由兩個結構域組成，與金葉連翹FiPLR三維結構高度相似：較大的結構域約N端約200個氨基酸殘基構成，負責與IRL蛋白的輔助因子NADPH結合；較小的結構域由C端約100個氨基酸殘基構成，形成IRL蛋白的底物結合口袋。FtIFR蛋白具有SDR家族的典型特征，其N端和C端聚集在活性中心口袋周圍，而其活性中心口袋較紫花苜蓿MsIFR狹窄且與FiPLR更為接近。在氨基酸組成上，FtIFR的活性中心有較大的可變性，由F164、V266和A271構成，而FiPLR蛋白活性中心由F164、V268和L271構成，其中F164氨基酸殘基在所有的IFR、IRL和PLR中高度保守。這在一定程度上解釋了IRL、PLR和PCBER等SDR家族成員雖然在氨基酸序列上高度相似，但其生物學功能確各有差異的原因。

2.5 分子進化分析

圖6 不同植物IRL氨基酸序列的系統發育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of IRL protein in different plants

NCBI數據庫中IFR相關的數據較少，在有花植物中主要有IFR、IRL和PLR三類酶蛋白基因共150多條相關序列。采用MEGA4.0軟件[11]，通過鄰接法構建基于有花植物中13個物種IRL相關氨基酸序列的系統發育樹。由圖6可知，同為蓼科植物的FtIRL與金蕎FcIFR同源關系最近，且和木犀科的金葉連翹PLR聚為一大類(Cluster Ⅰ)；其他植物的IFR和IRL聚為一大類，其中雙子葉植物聚為Cluster ⅡA，單子葉植物聚為Cluster ⅡB。多數植物的IRL在進化上較為保守，符合植物分類規律。苦蕎和金蕎雖然在氨基酸序列上與其他植物的IFR相關基因有較高的同源性，但其生物學功能可能更接近PLR。

3 討 論

在中國、日本和韓國等亞洲國家，苦蕎作為一種具有保健價值的糧食作物日益受到關注[12]。黃酮類化合物的含量是衡量苦蕎品質高低的標準之一。異黃酮類化合物主要分布于豆科植物中(Leguminosae)[13]，但苦蕎中的黃酮類化合物是以蘆丁為代表的黃酮醇類物質及其衍生物，目前還未見從苦蕎中分離出異黃酮的報道。本研究以苦蕎黃酮類化合物含量最高的花蕾為材料，采用RT-PCR技術獲得了FtIRL，但卻未能從甜蕎中獲得與IRL類似的序列。通過序列分析，FtIRL與高黃酮含量的金蕎愈傷組織中分離的FcIFR在基因的長度和結構上同源性較高，表明二者編碼的蛋白可能具有相似的生物學功能。蛋白質高級結構的分析結果和基于氨基酸序列的分子進化結果均進一步表明，FtIRL在結構和進化上更加接近PLR。

苦蕎和金蕎中的黃酮類化合物的合成存在著不同的分支途徑，隨著各分支途徑的代謝的強弱不同，相關基因的表達豐度存在一定差異。而苦蕎中FtIRL可能與未直接參與異黃酮的合成過程，很可能作為SDR家族中的成員從而參與其他次生代謝產物的合成反應。近年來，隨著對苦蕎抗逆生理研究的深入，發現苦蕎中黃酮類化合物含量的上升常常伴隨著逆境的出現[14-16]，這在一定程度上反映了苦蕎中黃酮類化合物的含量與FtIRL表達豐度之間的潛在關系。例如：水稻OsIRL在稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)和茉莉酸的誘導下，其表達量上升[17]；研究者從西柚中鑒定出IRL基因，該基因在紫外照射和真菌浸染時被誘導表達[18]；咖啡葉中CoIRL在真菌浸染和機械損傷的逆境下，表達量顯著上升[7]。

植物黃酮的生物合成，是由不同的基因所編碼的酶控制并以代謝流的方式流向不同的支路，從而形成了種類多樣、結構復雜的植物黃酮及其衍生物。FtIRL作為苦蕎SDR中的IRL類基因，其生物學功能還不甚明晰，與苦蕎中黃酮類化合物生物合成的關系以及對逆境的應答機制有待進一步研究。因此，對苦蕎FtIRL的研究有助于進一步認識苯丙烷類代謝途徑中不同基因的表達機制以及相應代謝產物的生理作用，從而獲得更多與苦蕎品質相關的功能基因，為高黃酮苦蕎轉基因育種提供實驗素材。

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Cloning and Sequence Analysis of the Isoflavone Reductase-like (FtIRL) Gene from Fagopyrum tatarium

ZHAO Hai-xia，LI Cheng-lei，BAI Yue-chen，CHEN Hui，WU Qi*
(College of Life and Basic Sciences, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The cDNA sequence of isoflavone reductase-like gene IRL from Fagopyrum tataricum was amplified by RT-PCR. Sequencing showed that the ORF of IRL gene from F. tataricum (named as FtIRL) was 942bp, probably encoding a protein of 313 amino acids. Further analysis indicated that the deduced FcIFR protein had homology values of 97% with other plants,IRLs. FtIRL possessed two short-chain dehydrogenase/reductase conserved motifs: a substrate-binding pocket and a NADPH binding site. The phylogenetic tree constructed based on amino acid sequences indicated that, although the amino acid sequence of IRL gene from F. tataricum had high homology with that of isoflavone reductase (IFR) genes from other plants, its biological function might be more similar to that of pinoresinol lariciresinol reductase (PLR).

Fagopyrum tataricum；isoflavone reductase-like protein；gene cloning；sequence analysis

Q943.2；S517.032

A

1002-6630(2012)11-0210-05

2011-07-04

趙海霞(1977—)，女，講師，碩士，研究方向為基因工程。E-mail：aasky8@163.com

*通信作者：吳琦(1973—)，男，教授，博士，研究方向為植物分子生物學。E-mail：wuqiwq@yahoo.cn