鹿蹄橐吾多糖LW21的分離純化及其結構分析

劉春蘭，杜 寧，徐桂云，黃 瀟，阿西娜

(1.中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081；2.中國科學院化學研究所， 北京 100080)

鹿蹄橐吾多糖LW21的分離純化及其結構分析

劉春蘭1，杜 寧1，徐桂云2，黃 瀟1，阿西娜1

(1.中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081；2.中國科學院化學研究所， 北京 100080)

目的：確定鹿蹄橐吾多糖LW21的結構，為探討鹿蹄橐吾多糖的藥理活性，合理利用鹿蹄橐吾這種植物資源提供依據。方法：水提取醇沉獲得鹿蹄橐吾水溶性粗多糖LW，經酸性乙醇分級和DEAE-SephdexA-25純化得多糖LW21。紙層析、醋酸纖維薄膜電泳和Sepharose CL-4B柱層析進行純度鑒定，LW21結構分析采用高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析及IR、NMR、GC和GC-MS等方法。結果表明：LW21為均一多糖，相對分子質量約為1.1×106。其單糖組成為鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)，物質的量比為7.4:11.9:25.7:40.0:14.9。多糖LW21為有分枝結構，主鏈由Glc和Man構成，其中其中Man主要以β(1→2)和β(1→6)糖苷鍵連接，β(1→2)糖苷鍵在3-O處和6-O處有分枝，β(1→6)糖苷鍵在2-O和4-O處有分枝，Glc也主要以β(1→2)及β(1→6)糖苷鍵連接，β(1→2)糖苷鍵在6-O處有分枝，β(1→6)糖苷鍵連接，在2-O處有分枝。分子支鏈由Ara、Rha、Gal構成。末端殘基為Gal、Ara、Rha、Glc。結論：鹿蹄橐吾多糖LW21是一新結構多糖，為首次從鹿蹄橐吾中分離得到。

鹿蹄橐吾；多糖；甲基化分析；結構分析

橐吾屬 (Ligularia Cass.)為菊科(Compositae)千里光族，全屬約有130種。該屬藥用植物較多，許多種類的根及根莖作為藏藥、維藥和民間草藥使用，有很長的藥用歷史[1]。鹿蹄橐吾，別名滇紫菀，是菊科植物鹿蹄橐吾(Ligularia hodgsonii)的干燥全草，分布于我國四川東部、湖北、湖南等省。其根及根莖收入云南省藥品標準，藥理研究表明醇溶物中具有祛痰鎮咳、殺菌消炎和抗腫瘤的活性[2-3]。鹿蹄橐吾的化學成分包括倍半萜類、生物堿、多羥基類小分子等[4]。劉春蘭等[5]對大黃橐吾水溶性多糖進行了研究，證明其具有清除自由基的功能。目前國內外對鹿蹄橐吾多糖結構的研究還未見報道。多糖的多種生物活性與它的化學結構密切相關，活性多糖的化學結構是其生物活性的基礎。因此本文選用鹿蹄橐吾為原料，對鹿蹄橐吾水溶性多糖提取、分離純化并測定其結構，為進一步探討鹿蹄橐吾多糖的藥理活性，合理利用鹿蹄橐吾資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹿蹄橐吾(Ligularia hodgsonii)全草，采自四川阿壩，由中國科學院植物研究所陳藝林研究員鑒定。

NaBH4美國Sigma-Aldrich公司；DEAE-SephdexA-25、Sephrose CL-4B 瑞典Pharmacia公司；乙醇、乙醚、乙酸乙酯、醋酸、苯酚、高碘酸、碘甲烷、二甲基亞砜等均為分析純。

1.2 儀器與設備

DB-5MS石英毛細管(30m×0.25mm，0.25μm) 美國GE公司；FC-95A餾分自助收集器 上海青浦滬西儀器廠；8002型電熱恒溫水浴鍋 天津市中環實驗電爐有限公司；LD4-8型離心機 北京醫用離心機；Qp2010A型氣相色譜質譜(GC-MS)聯用儀、Specord型紅外光譜儀日本島津公司；AVANCE400型超導核磁共振波譜儀 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 鹿蹄橐吾粗多糖LW的提取[6]

稱取5g干燥的鹿蹄橐吾，加入體積分數95%的乙醇回流脫脂后，按料液比1:12(m/V)在85℃水浴提取3h，再加入4倍體積的95%乙醇沉淀，靜置過夜，3000r/min離心10min，回收上清乙醇，沉淀用無水乙醇、乙醚洗滌后真空干燥后得粗品鹿蹄橐吾多糖LW。

1.3.2 鹿蹄橐吾純化多糖LW21制備

將粗多糖LW配成2g/100mL溶液，采用鏈酶蛋白酶與Sevag法聯合脫蛋白[7-8]。用pH2.5的酸性乙醇分級得LW2。LW2經DEAE-Sephdex A-25(2.5cm×90cm)柱層析，用0.5mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.75mL/min，每支試管接洗脫液2mL，苯酚-硫酸法顯色。根據苯酚-硫酸法檢測的結果合并收集相同峰位的組分，流水透析24h，去離子水透析24h，減壓濃縮至適當體積，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，常規干燥制備得多糖LW21。

1.3.3 多糖LW21純度鑒定

1.3.3.1 紙層析法[9-10]

用新華1號中速濾紙(15cm×40cm)進行層析，溶劑系統為乙酸乙酯-醋酸-水(體積比為4:1:1)，苯胺-鄰苯二甲酸試劑顯色。

1.3.3.2 醋酸纖維薄膜電泳法

采用 0.025mol/L硼酸鹽為電極緩沖液(pH12.5)，電壓250V，電泳時間30min，用0.5%甲苯胺藍乙醇溶液染色。

1.3.3.3 柱層析法[10]

取5mg多糖配成10mg/L溶液，取0.5mL Sephrose CL-4B(1.5cm×90cm)柱層析上樣，0.1mol/L NaCl溶液洗脫，流速0.45mL/min，每管收集2mL，根據苯酚-硫酸法測定多糖，繪制層析圖譜，觀察結果。

1.3.4 鹿蹄橐吾水溶性多糖LW21的相對分子質量測定

用0.5mL水溶解5mg標準葡聚糖上樣，以Sepharose CL-4B(90cm×1.5cm)層析，0.1mol/L NaCl洗脫，流速為0.22mL/min，苯酚-硫酸法測多糖分布，用標準葡聚糖已知相對分子質量的(MW分別為1.0×107、5.0×106、2.0×106、7.0×105、1.0×104)相對分子質量對數值為縱坐標，以洗脫體積(Ve)為橫坐標，繪制lgMw-Ve標準曲線[11-12]。

同樣條件下測定LW21的洗脫體積，與標準曲線對照，求出相對分子質量。

1.3.5 單糖組成分析

取2mol/L H2SO4完全水解后進行紙層析[13]。

取1mg粗多糖，溶解于3mL三氟乙酸水溶液(2mol/L)中，120℃保溫1h，氮氣除去三氟乙酸水溶液。加入硼氫化鈉50mg氮氣流保護酸水解，加吡啶4mL，90℃水浴10min，加4mL乙酸酐90℃水浴20min，乙酰化上樣，后進行GC分析[14-15]。

GC條件：OV-210毛細管柱(30m×0.32mm，0.25μm)；柱溫100℃升高到250℃，程序升溫5℃/min；載氣為氫氣；流速為1.5mL/s；檢測器：FID。

1.3.6 LW21的結構分析

1.3.6.1 紅外光譜(IR)分析與核磁共振譜分析

取1mg多糖LW21與10mg KBr研磨混合后壓片，紅外光譜儀在500～4000cm-1掃描[16]進行IR分析。稱取10mg多糖LW21，溶于重水(D2O)，進行核磁共振波譜分析[17]。

1.3.6.2 高碘酸氧化與Smith降解分析

準確稱取50mg樣品按文獻[19-20]進行高碘酸氧化、Smith降解，透析。透析后對袋內外產物GC分析。GC條件同1.3.5節。

1.3.6.3 LW21的甲基化糖制備

取6mg LW21，用二甲基亞砜、固體氫氧化鈉粉、碘甲烷按文獻[17]進行甲基化，IR檢測確證甲基化完全后，將甲基化產物用4mol/L三氟乙酸，100℃水解4h，氮氣吹干，經乙酰化制成乙酰化衍生物[21-23]，GC-MS定性和定量分析。

GC條件：柱室初始溫度120℃，以5℃/min升至250℃，保持10min，檢測器和進樣器均為250℃。載氣為氦氣，線速41cm/s。

MS分析條件：EI源，離子源溫度250℃，離子化電勢70eV。

樣品用二氯甲烷溶解直接進樣。根據色譜的各峰面積計算各種連接方式的物質的量比，根據各峰的保留時間和質譜碎片峰，確定其連接方式。

2 結果與分析

2.1 鹿蹄橐吾水溶性多糖的提取及分離純化

鹿蹄橐吾經水提醇沉后得粗多糖LW，提取率為4.78%。LW為灰白粉末狀固體，溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有機溶劑。粗多糖經分離純化得多糖LW21。LW21為淺棕色粉末狀，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇等有機溶劑。

2.2 鹿蹄橐吾水溶性多糖LW21的純度鑒定

LW21經Sephrose CL-4B柱層析，苯酚-硫酸法檢測得單一對稱峰(圖1)，醋酸纖維薄膜電泳呈單一譜帶(圖2)，紙層析呈單一斑點。說明LW21為相對分子質量及極性均一的純化多糖[18]。用凝膠洗脫法與標準葡聚糖對照測LW21的相對分子質量約為1.1×106。

圖1 多糖LW21的Sepharose CL-4B柱層析譜圖Fig.1 Chromatogram of LW21 on Sepharose CL-4B

圖2 多糖LW21的醋酸纖維薄膜電泳譜帶Fig.2 Cellulous acetate electrophoresis of LW21

2.3 鹿蹄橐吾水溶性多糖LW21的組成分析

LW21經紙層析和氣相色譜GC分析結果見圖3。經與標準譜圖(譜圖略)比較，結果表明，其單糖組成為：鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)，物質的量比為7.4: 11.9: 25.7: 40.0: 14.9。LW21是由5種單糖殘基組成的雜多糖。

圖3 多糖LW21的GC譜圖Fig.3 GC chromatogram of LW21

2.4 鹿蹄橐吾水溶性多糖LW21的結構分析

2.4.1 鹿蹄橐吾水溶性多糖LW21的IR、NMR分析

圖4 多糖LW21的紅外譜圖Fig.4 IR spectrum of LW21

由圖4可知，在3417、2941、1100cm-1附近處出現多糖的特征吸收峰，1000cm-1附近有3個吸收峰，說明LW21可能含有吡喃環和呋喃環。890cm-1處的吸收峰說明多糖LW21有β型糖苷鍵。810cm-1處的吸收峰說明多糖LW21也有α型糖苷鍵[10,15-16]。

圖5 LW21甲基化產物GC譜圖Fig.5 GC-MS of Chromatogram of LW21

多糖LW21以AVANCE400型核磁共振譜分析儀測定1H NMR，由圖5可知，在1H NMR譜中δ4.8～5.5范圍有5個C1上質子的信號，化學位移δ值大于5.0的有1個，小于5.0的有5個，說明多糖LW21中存在α型和β型兩種[19]，與紅外分析結果相符。

2.4.2 高碘酸氧化和Smith降解

LW21進行高碘酸氧化，經紫外光譜在223nm檢測反應完全后，測得每摩爾己糖消耗0.99mol IO4-，大于釋放甲酸量(0.40mol)的2倍，表明其除1→末端及1→6糖基外，尚有可被高碘酸氧化但不產生甲酸的1→2或1→4糖基，即可氧化糖基占70.30%，不可氧化糖基占29.70%[20]。

LW21經Smith降解，對蒸餾水透析。袋內、袋外產物進行GC分析，結果如表1所示。

表1 Smith降解結果分析Table 1 Smith degradation analysis

由表1可知，袋內上清和沉淀部分均檢出Gal和Man，袋外部分檢出赤蘚糖(Ery)和甘油(Gly)。根據高碘酸選擇性氧化的規則，說明多糖LW21中Gal和Man有不被高碘酸氧化的鍵型。袋外檢出赤蘚醇、甘油，說明多糖LW21中存在1→4、1→4,6、1→末端、1→2、1→6、1→2,6鍵型。

2.5 LW21的甲基化及其產物分析

為確定糖苷鍵的位置，對甲基化的多糖LW21經水解、還原、乙酰化后的產物作氣相色譜-質譜分析[21]，結果列于表2。

根據其衍生物的氣相色譜相對保留值和每個組分的質譜圖可分析各組碎片峰，可確定甲基、乙酰基在衍生物分子上的位置，從而可確認多糖中單糖組成和糖苷鍵連接位置[22]。

由表1中LW21甲基化產物GC-MS分析可知，LW21單糖組成為Rha、Ara、Man、Glc、Gal，與PC和GC分析結果一致。含有β(1→2)糖苷鍵的Man的物質的量比為15.0，在多糖LW21中所占比例最大，構成多糖LW21的主鏈之一，且在3位和6位上有分支，由物質的量比可計算出平均每15個糖殘基有7個分枝。含有β(1→6)糖苷鍵的Man的物質的量比為14.0，也構成主鏈，且在2位和4位上有分枝，由物質的量比可計算出平均每2個糖殘基有1個分枝。含有β(1→2)糖苷鍵的Glc的物質的量比為12.0，在多糖LW21中所占比例較大，構成多糖LW21的主鏈之一，且在6位上有分支，由物質的量比可計算出平均每3個糖殘基有2個分枝。含有β(1→6)糖苷鍵的Glc的物質的量比為7.0，也構成多糖LW21的主鏈之一，且在2位上有分枝，由物質的量比可計算出平均每11個糖殘基有4個分枝。支鏈由Ara、Rha、Gal構成，其中Ara以1→2，1→4或1→5連接，Rha以1→2，1→5連接，Gal以1→6，1→2,3或1→4, 6連接，與高碘酸氧化Smith降解時在袋內未檢出Rha、Ara、Man，袋內檢出Gal的分析結果一致。Gal、Ara、Rha、Glc都有一部分構成分子的末端殘基[23]。

表2 LW21甲基化產物的GC-MS分析Table 2 GC-MS analysis of methylated LW21

3 結 論

鹿蹄橐吾經提取分離純化得均一多糖LW21，相對分子質量約為1.1×106。經高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析、IR分析、NMR波譜分析，結果均一致。證明LW21的基本結構為Glc和Man構成主鏈，其中Man主要以β(1→2)和β(1→6)糖苷鍵連接，β(1→2)糖苷鍵在3-O處和6-O處有分枝，β(1→6)糖苷鍵在2-O和4-O處有分枝；Glc也主要以β(1→2)及β(1→6)糖苷鍵連接，β(1→2)糖苷鍵在6-O處有分枝，β(1→6)糖苷鍵連接在2-O處有分枝。分子支鏈由Ara、Rha、Gal構成，其中Ara以1→2、1→4或1→5連接，Rha以1→2、1→5連接，Gal 以1→6、1→2, 3或1→4, 6連接。末端殘基為Gal、Ara、Rha、Glc。LW21是多分支結構復雜的中性多糖。

鹿蹄橐吾多糖LW21為首次從四川天然鹿蹄橐吾中分離得到的均一多糖并測定其一級結構。對于此多糖的構效關系還有待于進行后續工作。

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Isolation, Purification and Structural Analysis of Water-Soluble Polysaccharide LW21from Ligularia hodgsonii

LIU Chun-lan1，DU Ning1，XU Gui-yun2，HUANG Xiao1，A Xi-na1
(1. College of Life and Environmental Science, Minzu University of China, Beijing 100081, China；2. Institute of Chemistry Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China)

Objective: to isaolate, purify and structurally characterize a water-soluble polysaccharide from the whole herbs of Ligularia hodgsonii. Methods: crude polysaccharide named as LW was extracted from Ligularia hodgsonii. A ploysaccharide fraction named as LW21 was obtained after acidic ethanol fractionation and DEAE-Sephadex A-25 gel filtration. The purity of LW21 was identified by paper chromatography, Sepharose CL-4B chromatography and cellulous acetate electrophoresis, and its structure was analyzed by HIO4oxidation, Smith degradation, methylation, IR, NMR, GC and GC-MS. Results: LW21was a homogenous polysaccharide. LW21 was composed of rhamose (Rha), arabinose (Ara), mannose (Man), glucose (Glc) and galactose (Gal) with a molar ratio of 7.4: 11.9: 25.7: 40.0: 14.9. Its average molecular weight was 110 kD. Its main chain was made up of β-(1→2)-linked or β-(1→6)-linked Man, and β-(1→2)-linked orβ-(1→6)-linked Glc residues. The β-(1→2)-linked Man was substituted at 2-O and 4-O; β-(1→6)-linked Man was substituted at 3-O and 6-O; and β-(1→2)-linked Glc was substituted at 6-O; β-(1→6)-linked Gal was substituted at 2-O. The side chain was composed of Rha, Ara and Gal. The non-reduced end was composed of Gal, Ara, Rha and Glc. Conclusion: LW21 is a new polysaccharide isolated from Ligularia hodgsonii for the first time.

Ligularia hodgsonii；polysaccharide；methylation analysis；structural analysis

Q629

A

1002-6630(2012)11-0057-05

2011-05-27

中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(0910KYZY44)；“111創新引智計劃”工程項目(B08044)；中央民族大學“985”工程項目(MUC985-9)

劉春蘭(1962—)，女，教授，碩士，研究方向為多糖化學。E-mail：liuchunlan888@yahoo.com.cn