pH和氮素形態對紫花苜蓿根瘤特性的影響

俞 艷，劉曉靜，齊敏興，張曉磊，付 萍，王巧玲，張曉玲，李鴻燕

（1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070）

紫花苜蓿（Medicago sativa）素有“牧草之王”的美稱，是一種蛋白質含量高的優質豆科牧草。在其生長過程中受到多種因素的影響，土壤pH是主要的因素之一。苜蓿在我國主要分布于北方中性和微酸性土壤中，但其適宜的土壤pH為6.5～7.5。紫花苜蓿接種根瘤菌可以提高其產量和品質［1］，但苜蓿根瘤菌一般不耐酸，酸性土壤降低了根瘤菌與宿主植物之間的親和性，抑制了根瘤菌的存活，致使豆科牧草生物固氮受阻［2，3］，同時土壤pH 影響紫花苜蓿根系鐵離子的吸收［4］。氮是植物生長發育不可缺少的營養元素，是植物體內許多重要有機化合物的組成成分［5］，對植物的生命活動以及產量的形成與品質的優劣均有著極為重要的作用［6］。施氮對紫花苜蓿的早期生長具有積極意義［7］。硝態氮與銨態氮均能被植物吸收，但不同形態的氮素對植物生理特性和生長發育的影響不同［8］。為進一步探討pH和不同氮素形態對紫花苜蓿根瘤特性的影響，采用砂培方法，通過營養液控制pH梯度和氮素形態，排除其他外部環境的影響，更加客觀直接的反應試驗結果，以期為紫花苜蓿最適的pH范圍和氮素供應提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試品種

供試苜蓿品種為甘農3號紫花苜蓿（Medicago sativavar.Gannong No.3），由甘肅農業大學草業學院提供。選取大小均勻，顆粒飽滿種子，先用95%乙醇浸泡5min，再用0.1%HgCl2溶液滅菌6～10min，然后無菌水沖洗5～6次。

1.2 供試根瘤菌菌株

中華根瘤菌（12531），由甘肅農業大學草業學院提供。將菌株進行平板劃線培養，挑起單菌落接種于YMA培養基上，在28℃培養箱中培養72h，用無菌水洗下根瘤菌體，裝入無菌三角瓶中。

1.3 營養液配制

Fahraeus無氮植物營養液配制方法：Na2HPO4·12H2O 0.15g，MgSO4·7H2O 0.12g，檸檬酸鐵0.005g，CaCl2·2H2O 0.1g，KH2PO40.1g，Gibson微量元素1mLH2O 1 000mLGibson微量元素液：H3BO32.86g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CuSO4·5H2O 0.08g，MnSO4·4H2O 2.03g，Na2MoO4·2H2O 1.26g，H2O 1 000mL。

1.4 實驗設計

采用砂培方法，選用直徑7.0cm、高8.5cm的塑料杯，裝入高溫滅菌的粗砂230g。每杯播種10粒已消毒的種子，覆蓋干沙50g。pH設5、6、7、8、9共5個梯度；設氮素形態為硝態氮和銨態氮2種，以Fahraeus無氮植物營養液為基本營養液，分別以Ca（NO3）2和（NH4）2SO4為氮源配制所需營養液，用HCl和NaOH溶液把營養液pH分別調成5、6、7、8、9，一次性施入。待種子發芽時，每個塑料杯接種新培養的苜蓿根瘤菌液2mL。每6個塑料杯為1個重復，放入水培盒中，每個處理設3次重復，隨機排列。營養液每水培盒500mL，使液面保持一致，并標出液面線。實驗均在實驗室條件下進行，期間每隔4d補充1次蒸餾水，處理60d后測定各項生理指標。

1.5 測定指標與方法

根瘤數 數每個植株的根瘤總數；根瘤重 將摘下的根瘤在電子天平上稱鮮重；固氮酶活性 采用乙炔還原法測定［9，10］。稱取0.2g的新鮮根瘤置于7mL玻璃瓶中，加蓋橡皮塞后，從中吸出0.7mL空氣，注入0.7mL乙炔，室溫下反應30min，待機器穩定，用微量注射器抽取混合氣體25μL注入氣相色譜儀（GC）進樣柱中，測定C2H2、C2H4峰值。然后，在同樣條件下用標準乙烯測定并繪制乙烯的標準曲線，由此計算根瘤樣品的固氮酶活性。每個處理3次重復。測定儀器為GC－7890F氣相色譜儀，柱溫180℃，進樣器150℃，FID檢測器170℃。氣體壓力N2為0.3mPa，H2為0.08mPa，空氣為0.15mPa。

C2H4水平［μmol/（g·h）］＝hx（樣品峰面積）×C（標準 C2H4水平，μmol/mL）×V（培養容器體積，mL）/hs（標準 C2H4峰面積）×24.9×t（C2H2反應時間，h）×m（瘤重，g）。

植株根系全氮含量 植株的全氮含量采用濃H2SO4－H2O2法測定［11］。

地上、地下生物量 采用105～110℃殺青30min，70～80℃烘至恒重，稱重。

1.6 數據處理

采用Excel 2003進行數據處理和圖表繪制，并采用SPSS 16.0進行單因素方差分析（one－way ANOVA）和新復極差法（Duncan法）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 pH和氮素形態對紫花苜蓿根瘤數的影響

根瘤數的多少可以直接反映根瘤菌固氮效率的強弱，結果表明（圖1），在其他營養供應充分的條件下，pH和不同氮素形態均對紫花苜蓿根瘤數目有顯著影響。在給定的pH范圍，對于不同氮素形態處理的紫花苜蓿，均以pH為7時根瘤數最多，過高或過低的pH對結瘤的形成均存在抑制作用。同時，氮素形態的不同也直接影響紫花苜蓿根瘤的形成，銨態氮培養下的根瘤數顯著大于硝態氮培養。表明中性pH和銨態氮更有利于紫花苜蓿根瘤的生長與形成。此結果與嚴君［12］在大豆上的施氮效果一致。

圖1 pH和氮素形態下的紫花苜蓿根瘤數Fig.1 Effect of pH value and nitrogen forms on root nodule number of alfalfa

2.2 pH和氮素形態對紫花苜蓿根瘤重的影響

pH和氮素形態對紫花苜蓿根瘤重具有顯著影響（圖2）。在給定的pH梯度下，不同氮素形態處理的紫花苜蓿，pH均為7時根瘤重達到最大值，低pH和高pH對根瘤重的增大均具有抑制作用。同時，銨態氮培養下的根瘤重顯著大于硝態氮。

圖2 pH和氮素形態下的紫花苜蓿根瘤重Fig.2 Effect of pH value and nitrogen forms on nodulation of alfalfa

2.3 pH和氮素形態對紫花苜蓿固氮酶活性的影響

銨態氮培養下紫花苜蓿的固氮酶活性要顯著高于硝態氮培養（圖3），說明銨態氮更有利于紫花苜蓿固氮酶活性的提高。同時，在給定的pH范圍內，在pH為7時，2種不同氮素形態培養下紫花苜蓿的固氮酶活性都最高。pH＝5和pH＝9時，固氮酶活性最低，說明偏酸和偏堿的環境對固氮酶活性均有抑制作用。而處理在pH＝6時的固氮酶活性強于pH＝8時的固氮酶活性，說明偏酸的環境下固氮酶活性比偏堿環境下更高，表明甘農3號紫花苜蓿對偏酸環境具有一定的耐受性。

圖3 pH和氮素形態下的紫花苜蓿固氮酶活性Fig.3 Effect of pH value and nitrogen forms on nitrogenaseactivity of alfalfa

2.4 pH和氮素形態對紫花苜蓿根系全氮含量的影響

pH和氮素形態對紫花苜蓿根系全氮含量具有顯著影響。在5個pH處理中，pH為7時根系全氮含量最高，pH為5時最低（圖4）。同時，堿性處理下的根系全氮含量要顯著高于酸性處理，說明這個處理對偏堿性環境有一定的耐受性，這可能與根瘤菌產酸的生理特性有關，由于根瘤菌在共生固氮過程中分解營養物質產生酸，降低了根際周圍的pH。從氮素形態對其影響來看，銨態氮培養下紫花苜蓿根系全氮含量要顯著高于硝態氮培養，說明銨態氮更有利于紫花苜蓿固氮酶活性的提高。

2.5 pH和氮素形態對紫花苜蓿地上、地下生物量的影響

對不同pH和氮素形態處理下的植株生物量進行方差分析，各個處理間差異顯著（表1）。pH為7時，紫花苜蓿地上和地下生物量均為最高。pH小于7時，生物量隨pH的增加而增加，pH大于7時，生物量隨pH的增加而減少。pH大于7時的地上和地下生物量均高于pH值小于7時，這可能是由于在根瘤菌與植株的共生過程中，分離了其他營養物質產生酸，降低了根際周圍的pH值，從而減弱了pH對根瘤菌侵染的抑制作用。同時，銨態氮處理下的植株地上和地下生物量都高于硝態氮處理，表明銨態氮更有利于紫花苜蓿植株生物量的積累。司江英等［8］的研究也表明，以NH4＋－N為氮源的白羽扇豆生物量積累和根冠比也高于NO3－－N。

圖4 pH值和氮素形態下的紫花苜蓿根系全氮含量Fig.4 Effect of pH value and nitrogen forms on root total nitrogen content of alfalfa

表1 pH值和氮素形態對紫花苜蓿地上、地下生物量的影響Table 1 Effects of pH value and nitrogen forms on aboveground and underground biomass of alfalfa

3 討論

研究結果表明，紫花苜蓿是對pH脅迫敏感的植物，過低或過高的pH對苜蓿與根瘤菌的共生固氮效果具有抑制作用。氮素是植物體內蛋白質、核酸、葉綠素和一些激素等的重要組成部分，是限制植物生長和產量形成的重要因素［12，13］。紫花苜蓿與根瘤菌的有效共生作用除了受品種、菌系影響外，往往受到生態環境與肥力的影響［14］。總之pH為7或略微偏堿性條件較適宜紫花苜蓿的生長，苜蓿對堿性條件的耐受性更強于酸性條件。根瘤菌的生長有一個最適的pH范圍，pH過高或過低時，根瘤菌生長速率較低，導致總根瘤數相對較少。關于低pH抑制根瘤菌和苜蓿根生長的機理，可能是由于低pH導致信號分子（NF）量減少，降低了信號分子的活性并使根瘤菌對植物的信號分子的修飾、分解作用受到影響，甚至抑制nod基因的表達，降低了根瘤菌對苜蓿根毛的侵染能力；在強酸條件下，苜蓿根系質膜H＋－ATPase酶的活性會發生變化，以減輕苜蓿根系受到傷害［15］。同時，低pH脅迫下，苜蓿對水分和養分的吸收能力下降，致使苜蓿的光合作用降低，影響結瘤過程中根瘤菌糖類和ATP的供應，從而導致苜蓿根系結瘤減少和生長受阻。而在高pH下紫花苜蓿的結瘤固氮強于低pH下，可能與苜蓿根瘤菌產酸的生理特性有關，降低了根際周圍的pH，使紫花苜蓿的生長狀況比實際pH梯度時生長的好，相關機理還有待進一步研究。

同時在本研究中，銨態氮下培養的紫花苜蓿根瘤數、根瘤重、固氮酶活性、根系全氮含量和生物量均高于硝態氮下培養。分析原因，一方面是硝態氮使宿主根毛形成受阻遏或彎曲，硝態氮在呼吸消耗過程中減少了光合產物向根瘤的運輸，延遲了根瘤的形成和增大，從而進一步抑制固氮酶活性和根瘤固氮［16－19］，另一方面由于同化硝態氮的關鍵酶－NR與固氮酶對鉬具有競爭性，減少了鉬鐵蛋白的形成，從而降低了共生固氮的固氮酶活性［17］。同時嚴君［12］，宋海星［17］研究也表明，NO3－－N與NH4＋－N均不同程度地抑制根瘤固氮酶活性，但NH4＋－N對根瘤固氮的抑制作用明顯低于NO3－－N。而具體機理還有待進一步研究。

［1］寧國贊，李元芳，劉惠琴，等.紫花苜蓿接種根瘤菌的效果［J］.草業學報，1992，9（1）：50－51.

［2］Buerkert A，Cassman K G，Piedra R，et al.Soil acidity and liming effects on stand，nodulation，and yield of common bean［J］.Agronomy Journal，1990，（4）：749－754.

［3］Hebb D M，Richardson A E，Reid R.PCR as an ecological tool to determine the establishment and persistence of Rhizobium strains introduced into the field as a seed inoculant［J］.Aust J Agric Res，1998，49：923－934.

［4］李劍鋒，孫吉雄，安淵，等.不同pH值和Fe2＋脅迫對紫花苜蓿幼苗根系Fe3＋還原力的影響［J］.草原與草坪，2009（1）：7－10.

［5］陳曉遠，高志紅，李玉華.供氮形態和水分脅迫對苗期水稻吸收氮素營養的影響［J］.華北農學報，2008，23（1）：163－167.

［6］曾慶飛，賈志寬，韓清芳，等.施肥對苜蓿生產性能及品質影響的研究綜述［J］.草業學報，2007，22（7）：8.

［7］蒯佳林，劉曉靜，李文卿.不同氮素水平對接種根瘤菌紫花苜蓿生長特性的影響［J］.草原與草坪，2011，31（3）：56－59.

［8］司江英，汪曉麗，陳冬梅.不同pH和氮素形態對作物幼苗生長的影響［J］.揚州大學學報（農業與生命科學版），2007，28（3）：68－71.

［9］姚拓，張德罡，胡自治.高寒地區燕麥根際聯合固氮菌研究Ⅰ：固氮菌分離及鑒定［J］.草業學報，2004，13：106－111.

［10］Tang C，Hinsinger P J，Drevon J，et al.Phosphorus deficiency impairs early nodule functioning and enhances proton release in Roots of Medicago truncatula－l［J］.Annals of Botany，2001，88：131－138.

［11］魯如坤.土壤農業化學分析方法［M］.北京：中國農業科技出版社，2000：147－170.

［12］嚴君，韓曉增，王守宇，等.不同形態氮對大豆根瘤生長及固氮的影響［J］.大豆科學，2009，28（4）：675.

［13］孫曦.植物營養原理［M］.北京：中國農業出版社，1997.

［14］范富，張慶國，張永亮，等.施肥對紫花苜蓿根瘤的影響［J］.農業科技通報，2006（7）：96－98.

［15］郭奇梅，孫吉雄，安淵，等.酸和鐵脅迫對紫花苜蓿根系質膜 H＋－ATPase活性的影響［J］.草原與草坪，2009，134（3）：12－15.

［16］王樹起，韓曉增，喬云發，等.施氮對大豆根瘤生長和結瘤固氮的影響［J］.華北農學報，2009，24（2）：176－179.

［17］宋海星，申斯樂，馬淑英，等.硝態氮和氨態氮對大豆根瘤固氮的影響［J］.大豆科學，1997，16（4）：283－286.

［18］鄒春琴，王曉鳳，張福鎖.銨態氮抑制向日葵生長的作用機制初步探討［J］.植物營養與肥料學報，2004，10（1）：82－85.

［19］甘銀波，陳靜.大豆不同生長階段施用氮肥對生長、結瘤及產量的影響［J］.大豆科學，1998，17（4）：45－49.