辣椒抗逆性基因工程研究進展

劉克祿，田斌

辣椒（Capsicum annum L.）屬于茄科辣椒屬一年生或多年生草本植物，原產于拉丁美洲，由哥倫布發現后傳遍世界各地。辣椒因其特殊的口感和豐富的營養而深受人們的喜愛。目前隨著辣椒栽培品種的不斷退化及各種病蟲耐藥性的增強，需要不斷改進耕作條件及推出新品種才能適應生產需要。辣椒易受病毒、細菌和真菌的侵染，從而發生病毒病、疫病、白粉病、細菌性斑點病、根腐病、青枯病等。除此之外，辣椒還易受根結線蟲、蚜蟲、煙青蟲及各種非生物脅迫的為害。隨著生物技術的不斷發展，大批抗逆基因被相繼分離和克隆后轉化得到抗逆轉基因植株，并取得了一定成果。

1 植物抗逆分子機理

植物在整個生長周期內經常會遇到生物或非生物脅迫（如干旱、鹽堿、高溫、低溫、重金屬、氧化等）的影響，導致其生長發育緩慢或死亡。然而，植物經過長期的逆境脅迫體內，也會形成一系列抵御外界不良環境的的機制，從而保護其免受傷害。

Flor最早提出了基因對基因假說，病原與寄主植物的關系分為親和與不親和，親和與不親和病原分別含毒性基因（Vir）和無毒基因（avr），親和與不親和寄主分別含感病基因（r）和抗病基因（R）。當攜帶無毒基因的病原與攜帶抗病基因的寄主互作時，二者表現不親和，即寄主表現抗?。黄渌闆r下，二者表現親和，即寄主感病。病毒病的轉基因抗病機制主要表現為轉錄后的基因沉默，若入侵病毒的RNA基因組中包含與植物轉基因同源的基因片段，寄主植物就產生與病毒RNA基因互補的反義RNA，從而將病毒RNA破壞，產生抗病性。

植物在干旱脅迫條件下，晚期胚胎發生的豐富蛋白（LEA）具有脫水保護、參與滲透調節、清除自由基的作用；水孔蛋白大量累積；Rubisco活化酶表達量增加，這些都與植物的抗旱性緊密聯系。高溫可誘導植物產生大量的熱激蛋白，從而提高植物的耐熱性。植物耐鹽性中研究較多的是脯氨酸合成相關基因、甜菜堿合成相關基因和細胞內離子平衡調節信號轉導基因，耐鹽性越強的植物其體內脯氨酸、甜菜堿的含量也越高。

2 辣椒抗逆相關基因

2.1 與抗病毒相關的基因

植物病毒病已經成為植物界的“頑疾”，給農業生產帶來了極大損害。辣椒病毒病發生速度快、防治效果差，嚴重制約著辣椒的生產。據統計，世界各地報道的辣椒病毒有30余種，而我國辣椒病毒病主要由黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒侵染所致[1]。

研究表明，植物病毒外殼蛋白基因的表達與其細胞內抗病基因的表達水平一致，植物抗病能力越強，其抗病基因外殼蛋白（Coat protein，CP）基因的表達水平也越高。因此，許多研究都圍繞病毒CP基因展開。郭亞華等[2]利用Ri質粒構建了植物雙元表達載體，將黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的CP基因轉化至甜椒植株并獲得了轉基因植株。李華平等[3]通過在辣椒中超表達CMV的CP基因來獲得轉基因植株，從而研究其與辣椒抗病性的關系。結果表明，部分轉基因株系對CMV-BS和CMV-P表現抗性。商鴻生等[4]構建了一個包含CMV-CP和TMV-CP的雙功能基因的pBTC超表達載體轉化辣椒，研究這2個基因在植物抗病性中所起的作用，結果表明，在T0代植株中，約有半數植株的基因組中同時整合了這2個CP基因，而T1代純系中這2個基因同時存在的比例則不足10%；同時還發現，自交或雜交各代對CMV的抗性都能穩定遺傳和表達。Shin等[5]將辣椒的CMV和ToMV的CP基因在辣椒中超表達也提高了辣椒對CMVKor和辣椒溫和斑點病毒（Pepper mild mottle virus，PMMV）的抗性。以上結果證明，植物病毒CP基因與抗病性有關。

商鴻生等[4]對辣椒轉CMV的CP基因F1和F2植株的分離情況進行了統計，發現抗卡那霉素和抗CMV都是單基因顯性遺傳。據報道，CMV是由部分顯性和隱性基因所控制[6]。但Kang等[7]指出，Cmr1基因可以控制CMV的發生，是顯性遺傳并可以控制CMV的不同生理小種。目前，CMVP0已被育種家嚴格控制，但CMVP1已呈逐年加重趨勢，從CMVP0中克隆得到的病毒外殼蛋白基因不僅可以覆蓋整個病毒基因的DNA序列，還可以抗黃瓜花葉病毒的不同生理小種[8]。黃粵等[9]從辣椒PMMVQD株系中分離克隆得到病毒CP基因，對基因序列分析表明，PMMV病毒在進化過程中相當穩定。

除了病毒CP基因在植物的抗病性中起著不可忽視的作用外，在辣椒中超表達的Tsi1基因也可以保護辣椒免受PMMV和CMV的侵染[10]。Kim等[11]利用黃瓜花葉病毒的衛星RNA轉化辣椒，衛星RNA基因可穩定遺傳，只是轉基因后代對CMVKor和CMV-Y的抗性有所不同。Ruffel等[12]指出，辣椒中pvr2基因存在2個等位基因pvr21和pyr22，它們控制PVY的產生，從辣椒抗病毒敏感型植株中分離的eIF4E基因是pvr2的互補基因，轉eIF4E基因的辣椒抗病性喪失。

2.2 與抗細菌相關的基因

早期，人們就從天蠶血淋巴中誘導出了各種抗菌蛋白。目前，抗細菌基因主要有抗菌肽類、溶菌酶類和抗菌蛋白類，其中昆蟲抗菌肽類基因的研究最多。李乃堅等[13]將昆蟲抗菌肽B、D基因導入辣椒栽培品種后發現，轉基因植株都具有較強抗青枯病的能力。Jan等[14]將天蠶細胞中分離得到的抗菌肽B基因在番茄中超表達，不僅提高了植株抗青枯病的能力，還提高了植株抗細菌性斑點病的能力。雙價抗菌肽基因（Shiva A and Cecropin B）在臍橙中超表達可提高植株對潰瘍病的抵抗力[15]。李穎等[16]利用農桿菌介導技術獲得了轉抗菌肽基因辣椒植株，通過對自交系抗青枯病鑒定的篩選，獲得了具有抗青枯病能力的轉基因穩定株系，轉基因后代中，果實性狀基本不變，外源基因的遺傳也相對穩定。廖富蘋等[17]將抗菌肽D基因導入辣椒，發現目的基因在轉基因后代（F4）中能穩定表達。劉建軍等[18]檢測了轉抗菌肽B、D基因辣椒的外源目的蛋白，表明轉基因辣椒中抗菌肽目的基因的表達也是忠實的?？咕幕虿粌H能提高植物的抗病性，在轉基因后代中也能穩定表達，因此對轉基因植物安全性評價具有重要意義。

2.3 與抗真菌相關的基因

植物抗真菌基因主要是水解酶類、滲透蛋白類、抗菌蛋白和抗菌肽類、植物保衛素、降解酶及毒素、激活防御基因等。研究最多的是水解酶類，其中幾丁質酶基因和β-1，3葡聚糖酶基因應用最為廣泛，并已成功轉化植物體和獲得抗病植株。在辣椒方面，敬國興等[19]將葡聚糖酶基因和幾丁質酶基因轉化辣椒，分子檢測證實外源基因整合到了辣椒基因組DNA中；抗病性檢測證明轉基因辣椒子葉對疫病有很強的抗性。

2.4 與抗蟲相關的基因

辣椒蟲害主要有煙青蟲、根結線蟲和蚜蟲，煙青蟲幼蟲蛀食花、果，造成辣椒落花落果，根結線蟲主要為害辣椒根系，蚜蟲主要傳播病毒病。許多抗蟲基因的研究由此展開，CpTI 基 因[20]、cryIAc基因[21]都是抗蟲基因，已被用于辣椒轉化。李淑敏等[22]分離得到了與抗辣椒根結線蟲相關的WRKY基因，包括WRKY2a、WRKY2b、WRKY2c、CaWRKY1、WRKY1和CaWRKY2，其中WRKY2a、CaWRKY2基因受根結線蟲誘導表達；而CaWRKY1基因只在根和葉中表達，在莖中不表達。將來自辣椒的抗根結線蟲基因CaMi在番茄中超表達，基因表達譜分析顯示，該基因在番茄根、葉片和花中表達量高，在莖中表達量偏低，而在果實中不表達，進一步的結果表明，超表達的植株對根結線蟲的抗性顯著提高[23]。辣椒CaSn基因屬于snakin基因家族成員，實時定量表達分析結果表明，該基因由根結線蟲侵染誘導表達，此外，病毒誘導的基因沉默實驗表明，該基因參與了植物抗根結線蟲防御反應，CaSn基因也是辣椒中第一個分離出來的抗根結線蟲基因[24]。

2.5 其他脅迫相關基因

病菌感染、干旱、水澇、除草劑等都能使辣椒受到氧化脅迫而使為害加劇，從而造成植株早衰和減產。Zambounis等[25]從番茄中克隆了sod基因，將其轉化入辣椒中發現，在一定濃度的氧化脅迫條件下，轉基因株系抗氧化能力有所增強。Chatzidimitriadou等[26]同樣將來自番茄的sod基因轉入辣椒中，發現在甲基紫精處理和干旱脅迫誘導下，轉基因植株sod基因均上調表達，并且抗脅迫和莖尖再生能力大大加強。

辣椒CaPF1基因在生物脅迫和非生物脅迫中起重要作用，可以提高轉化擬南芥[27]、松樹[28，29]、馬鈴薯[30]等可以提高它們的抗旱性、耐冷性以及耐鹽性。甜椒熱激蛋白基因CaHSP18受熱激和低溫誘導表達[31]，并能提高轉基因植物的耐冷性[32]。

表1 辣椒抗逆性相關基因

目前已經克隆的辣椒基因中，部分基因受干旱脅迫誘導表達，比如 Ca-LEAL1[33]、Ca-DREBLP1[34]、CaPUB1[35]、CaXTH3[36]、CaRma1H1[37]、CaSRP1[38]等 ，都受干旱脅迫誘導上調或下調表達，并可能參與干旱脅迫反應。

Lee等[39]從辣椒中克隆了氧化還原酶CaOXR1基因和與ABI3-VP1基因家族相關的轉錄因子CaRAV1基因，分別將這2個基因、雙功能基因轉化擬南芥，結果表明，超表達植株對卵菌綱病害有一定抗性，且耐受高鹽和滲透脅迫的能力顯著提高。

3 展望

綜上所述，已經轉化了許多植物中分離并克隆的大量抗逆性相關基因，得到了部分辣椒或其他植物體，獲得抗逆性（表1）。

目前，對植物逆境脅迫的生理生化反應及抗逆性反應研究比較透徹，而具體的抗逆性分子機制研究還處于起步階段。同時，逆境脅迫相關基因數據庫還不完善，這些抗逆性基因的功能還需進一步分析。大多辣椒遺傳轉化的研究還處在實驗室階段，轉基因后代的遺傳穩定性及其他方面的性狀還有待進一步研究。

因此，進一步揭示植物抗逆性分子機制，培育抗真菌、細菌、病毒等病害，抗蟲及其他抗逆性轉基因辣椒新品種是未來辣椒抗逆性基因工程的重要方向之一。

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