河北省風疹病毒的分離鑒定及基因型分析

杜慧 郭玉 趙娜 朱貞 王晶輝 劉巖 張振國 許文波 李琦

風疹是兒童時期常見的傳染病，成人也可感染，表現為發熱，全身性皮疹，枕下、耳后及頸部淋巴結腫大和疼痛，孕婦在妊娠早期感染風疹病毒，可引起胎兒受感染，發生先天性風疹綜合癥(CRS)［1］，造成發育遲滯和胎兒畸形等嚴重后果。目前發現有多種病毒性感染所引起的癥候群與風疹相似，風疹亦可產生非典型的臨床表現或亞臨床感染［2］。因此，臨床診斷風疹并不可靠，往往需要實驗室診斷證實，病毒分離作為可靠的實驗室診斷方法已被廣泛采用，但因風疹病毒的細胞病變(CPE)進展緩慢且較難分辨，目前多采用病毒分離結合逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法進行鑒定。為了解河北省風疹流行特征，并為我省風疹控制工作提供分子流行病學的基線數據，采用病毒分離與RT-PCR相結合的方法對我省2011年發熱出疹病例咽拭子標本進行了鑒定，并對分離到的風疹病毒的基因特征進行了分析。

1 材料與方法

1.1 標本來源 所有標本均為采自于2011年1月至9月底疑似風疹病例的咽拭子。標本采集后保存在2 ml標本運輸液中，24 h內冷藏運輸到省級疾病預防控制中心(CDC)麻疹/風疹實驗室進行病毒分離，－70℃保存備檢。

1.2 病毒分離 咽拭子標本融化后取0.2 ml原液接種到長成單層的Vero/SLAM細胞上，于37℃培養，同時做好陰性細胞對照，每天觀察培養液的pH值及細胞狀態，7～10 d后將細胞培養管依次置于－70℃和室溫之間，待標本融化后依上述方法盲傳三代再進行鑒定。

1.3 風疹病毒RNA的提取及熒光定量PCR鑒定 使用Qiagen公司的QIAanp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取標本懸液中的病毒核酸;使用迅必達公司的麻疹和風疹病毒核酸雙重檢測試劑盒(實時熒光PCR法)進行熒光定量PCR的鑒定。風疹病毒陽性者送國家麻疹實驗室進行E1基因核苷酸序列測定和分析。

1.4 生物信息學分析 序列整理使用Sequencher 4.0.5軟件(GeneCode，Ann Arbor，Michigan，USA)，將 1107 個核苷酸片段序列截成用于分子流行病學監測所需的739個核苷酸片段(8731nt～9469nt);多序列比對、氨基酸和核苷酸同源性分析使用BioEdit Sequence Alignment Editor software(North Carolina St.University，USA)，Version 7.0.5.1;基因親緣性關系樹使用Mega 4.0 軟件(Sudhir Kumar，Arizona State University，Arizona，USA)中的鄰接法構建，建樹的可靠性通過1000bootstrap來評估。

2 結果

2.1 風疹病毒的分離和鑒定 2011年截止到9月底共收集發熱出疹病例咽拭子標本118份，在Vero/SLAM細胞上進行病毒增殖和分離后，全部進行了熒光定量PCR的鑒定，共分離出24株風疹病毒陽性標本，分布于全省8個市，其中保定7株(編號為:63、64、97、99、103、105、118)，石家莊 6 株(編號為:16、25、39、40、53、65)，廊坊 3 株(編號為:110、111、114)，承德、秦皇島、唐山各2 株(編號分別為 57、58;86、87;109、117)，滄州、張家口各1株(編號分別為77;91)。熒光定量PCR結果以下圖為例，見圖1。

圖1 麻疹、風疹病毒核酸雙重檢測擴增曲線

2.2 風疹病毒基因型的確定 將24株風疹病毒E1基因的739個核苷酸片段進行核苷酸序列測定和分析，并與WHO風疹病毒13個基因型的32株參考株相對應的核苷酸片段共同構建基因親緣關系樹［3，4］，結果顯示，分離的24株陽性毒株中有1株與WHO 2B基因型參考株(TAN-IND-00株、TS34-CH-00株和I11-IS-68株)同屬一個分支;其余23株與2株WHO 1E基因型的參考株(T14-CH-02株和M1-MAL-01株)同屬一個分支，而這些毒株又與分離于中國的參考株T14-CH-02株自成一簇，形成一個獨立的分支。因此可以確定，此23株風疹病毒陽性株屬于1E基因型，1株風疹病毒陽性株，即Hebei-SJZ-16屬于2B基因型。圖2所示為河北省風疹病毒陽性分離株與WHO基因參考株基于E1基因739個核苷酸構建的基因親緣性關系樹。

圖2 河北省風疹病毒陽性分離株與WHO基因參考株構建的基因親緣性關系樹

2.3 風疹病毒株核苷酸和氨基酸變異分析 在分離到的24株風疹病毒株中，23株1E基因型風疹病毒之間的核苷酸同源性為98.3% ～100%，氨基酸同源性為99.5% ～100%。23株1E基因型風疹病毒與WHO 1E基因型參考株(T14-CH-02株和M1-MAL-01株)之間核苷酸同源性分別為98.4% ～100%和96.8% ～100%，氨基酸的同源性分別為99.1% ～100%和99.1% ～100%。分離到的1株2B基因型風疹病毒與WHO 2B基因型參考株(TAN-IND-00株、TS34-CH-00株和I11-IS-68株)之間核苷酸同源性分別97.9%、96.4%和94.8%，氨基酸的同源性分別為100%、99.5%和99.5%。

河北省風疹病毒陽性分離株E1基因739個核苷酸中共有38個核苷酸發生變異。將24株風疹病毒分離株E1基因739個核苷酸推導的氨基酸序列與WHO各基因型參考株E1基因739個核苷酸推導的氨基酸序列進行比對，發現核苷酸變異為無義突變，氨基酸序列高度保守，N-型糖基化位點、血凝抑制位點和中和位點未發生改變，并且發現，1E基因型風疹病毒E1蛋白在第338位的氨基酸發生相同的突變，均突變為Phe338。

3 討論

風疹病原體是一種單鏈RNA病毒，有一個血清型，多個基因型。世界衛生組(WHO)將E1基因的739個核苷酸(8731-9469nt，159-404aa)作為基因型劃分和常規分子流行病學研究的標準靶序列，并將全球流行的風疹病毒劃分為兩個進化枝(Clade 1和Clade 2)，其中 Clade 1包括6個基因型(1B、1C、1D、1E、1F、1G)和4 個臨時基因型(1a、1h、1i、1j);Clade 2 包括3個基因型(2A、2B、2C)［5］。我國自2001 年發現1E 基因型之后，該基因型逐漸成為我國優勢流行基因型，我國各省的風疹爆發主要與1E基因型風疹病毒有關［6］。然而，當前2B基因型風疹病毒的傳播未被阻斷，如2000年安徽省監測到2B基因型風疹病毒，2006年四川省報道從越南輸入2株2B基因型風疹病毒［7］，但從流行情況看，2B基因型風疹病毒在中國的流行為弱勢。通過河北省風疹病毒的分析結果可以看出，2011年河北省分離到的毒株以1E基因型為主，因此我們推斷1E基因型風疹病毒可能是河北省主要的本土流行株。河北省于2011年監測到一株2B基因型風疹病毒，提示我們今后應密切關注2B基因型在河北省的流行情況。從基因親緣性關系樹中還可以看出，同一市區在同一年份內引起風疹流行的傳播鏈有所不同，如Hebei-BD-64與Hebei-BD-105;不同的市區之間存在著相同的病毒傳播鏈，如Hebei-TS-117與Hebei-QHD-87，提示河北省風疹病毒流行是由1E基因型風疹病毒的多個傳播鏈引起的，且無明顯的地理分布傾向。

朱貞等［6］發現我國1E基因型風疹病毒在E1蛋白的第338位氨基酸為Phe338，而其他基因型及其他國家的1E基因型風疹病毒E1蛋白的該位點的氨基酸為 Leu338，氨基酸Phe338為我國風疹病毒E1蛋白所特有。河北省分離到的1E基因型風疹病毒中，E1蛋白的第338位氨基酸同樣為Phe338，符合我國1E基因型的流行特征，檢測結果又進一步驗證了朱貞等［6］的研究結論。

2011年，河北省建立了熒光定量PCR的方法檢測風疹病毒，該方法特異性好，靈敏度高，操作簡單安全，自動化程度高，不易污染，彌補了河北省只能依靠血清學檢測或臨床表現發現感染風疹病毒病例的空白。同時，河北省使用了雙重檢測試劑盒，同時檢測麻疹、風疹兩種病毒，能夠快速的對病例進行確定診斷，指導基層進行處置，經過近一年的實踐取得了良好的效果。

河北省首次成功分離出風疹病毒，并確定了河北省風疹病毒本土基因型，即以1E基因型風疹病毒流行為主，同時存在弱勢的2B基因型風疹病毒的流行。今后應繼續加強監測，從而獲得更加完整的監測數據，指導河北省風疹流行的控制工作。

1 Frey TK.Molecular biology of rubella virus.Adv Virus Res，1994，44:69-160.

2 盧錦漢，章以浩，趙鎧主編.醫學生物制品學.第1版.北京:人民衛生出版社，1995.619.

3 WHO.Global distribution of measles and rubella genotypes-update.WER，2006，81:474-479.

4 WHO.Update of standard nomenclature for wild-type rubella virus，2007.WER，2007，82:216-222.

5 朱貞，郭學斌，崔愛利，等.中國2007-2008年風疹流行病學和病毒基因特征分析.中國疫苗和免疫，2009，20:201-204.

6 朱貞，許文波，毛乃穎，等.2003-2007年中國風疹病毒基因特征分析.病毒學報，2008，24:7-16.

7 何吉蘭，朱貞，孫莉，等.四川省首次分離出的風疹野病毒的基因型分析.現代預防醫學，2007，34:1751-1752.