替勃龍對大鼠神經(jīng)細胞Bcl-2、Bax表達的影響

宋月平 蘇立凱 鐘婭莉 田文艷

研究發(fā)現(xiàn)，雌激素替代治療能使絕經(jīng)期女性卒中的相對危險度(RR)及與卒中相關(guān)的病死率下降［1］。然而雌激素替代治療對腦卒中的影響機制迄今仍不十分清楚。本文觀察了替勃龍在去勢大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷中腦缺血神經(jīng)細胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達的影響，旨在探討它們對缺血性腦損傷的神經(jīng)保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1 實驗動物 5月齡健康雌性SD大鼠30只，體重250～270 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(動物使用許可證號:SCXK2003-1-003)。試驗期間所有動物置于同一室內(nèi)，二級環(huán)境分籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫(21±4)℃，光照12 h，黑暗12 h。

1.1.2 實驗分組:將上述SD大鼠按體重隨機分為3組:假手術(shù)組、對照組、替勃龍組，每組10只。假手術(shù)組行下腹切開，見到雙側(cè)卵巢，但不切除任何組織;其余2組于腦缺血術(shù)前14 d切除雙側(cè)卵巢。替勃龍組，替勃龍(荷蘭歐加農(nóng)生產(chǎn)，南京歐加農(nóng)制藥分裝)0.25mg·kg－1·d－1，灌胃;對照組每日同等量蒸餾水灌胃。凡術(shù)中出現(xiàn)大鼠死亡，蛛網(wǎng)膜下腔出血或未存活到規(guī)定的時間點者，均為模型制作失敗，不納入本實驗，再隨機從備用組補充相應(yīng)的大鼠，以保證每組實驗大鼠數(shù)量不變。

1.2 腦缺血再灌注模型制作 用改良Longa法制作大腦中動脈阻斷(MCAO)模型［1］。以10%水合氯醛(0.33 g/kg)腹腔注射麻醉后，暴露并鈍性游離左側(cè)頸總動脈(CCA)，結(jié)扎同側(cè)CCA近心端和頸外動脈(ECA)分叉部，距CCA末端約5 mm處剪口，用直徑0.24 mm的日本尼龍線沿頸內(nèi)動脈(ICA)方向插入，深度由分叉部算約計(18.5±0.5)mm，于ICA近心端結(jié)扎該動脈，全層縫合切口，再灌注時抽出尼龍線10 mm。以動物清醒后爬行時向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)，嚴重時向右跌倒，提尾時右前肢內(nèi)收屈曲，為入選標(biāo)準(zhǔn)。于腦缺血手術(shù)2 h后再灌注，24 h后斷頭取腦。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)功能評分:參考Bederson等［2］的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)，于取腦前評分。0分:無神經(jīng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展右側(cè)前爪;2分:向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向右側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走，喪失意識。包括術(shù)后24 h內(nèi)死亡。

1.3.2 腦梗死體積測定:大鼠腦缺血2 h，再灌注24 h后斷頭取腦。取左側(cè)大腦半球，冠狀面均勻切成2 mm厚腦片，染色固定，照相測量并計算出總的梗死體積。用計算機多媒體彩色圖像分析系統(tǒng)測量腦梗死體積。

1.3.3 免疫組化細胞凋亡的檢測:大鼠腦缺血2 h，再灌注24 h后斷頭取腦，距額極3～5 mm冠狀切取材，放入4%多聚甲醛固定24 h后，制成石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色。①采用TUNEL法原位標(biāo)記DNA片段檢測凋亡細胞。具體步驟參照產(chǎn)品說明書，原位細胞凋亡檢測試劑盒為美國ROCHE公司出品。②采用鏈酶菌抗生物素蛋白過氧化物酶法(streptavidin peroxidase，SP)檢測抗凋亡基因Bcl-2、細胞凋亡誘導(dǎo)因子Bax的表達。Bcl-2、bax多克隆抗體購于河北博海生物工程有限公司。③采用多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus)。在光鏡下分析圖象，每張切片采集缺血周邊區(qū)具有代表性10個高倍視野，計算平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較進行方差分析，兩兩比較采用q檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 假手術(shù)組神經(jīng)功能評分為(1.1±0.4)分，替勃龍組(2.3 ±0.5)分，假手術(shù)組為(1.3 ± 0.5)分，假手術(shù)組和替勃龍組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 梗死體積 替勃龍組與對照組比較梗死體積縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 3組腦缺血模型大鼠梗死體積比較 n=10，

表1 3組腦缺血模型大鼠梗死體積比較 n=10，

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05;與對照組比較，#P ＜0.05

組別 半球體積(mm3) 梗死體積(mm3) 梗死體積百分比(%)260 ±8 47 ±5 18.2 ±2.2對照組 260±7 65±4* 25.3±2.4*替勃龍組 260±8 47±4# 18.2±2.2假手術(shù)組#

2.3 TUNEL標(biāo)記結(jié)果 缺血組對側(cè)僅見數(shù)個陽性細胞散在分布，缺血側(cè)可見大量黃棕色陽性細胞，以圓形為主。假手術(shù)組陽性細胞數(shù)10%，替勃龍組陽性細胞數(shù)11%，對照組陽性細胞數(shù)28%，與對照組比較替勃龍組陽性細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。見圖1。

2.4 Bcl-2、Bax在同側(cè)皮層表達的百分率 在腦組織切片中，Bcl-2、Bax陽性表達表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色深染。替勃龍組較對照組Bcl-2陽性細胞增多，Bax陽性細胞減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。見表2。

圖1 3組缺血側(cè)皮層陽性細胞(TUNEL×400)

表2 3組腦缺血模型大鼠腦皮層Bcl-2、Bax表達水平比較 n=10，

表2 3組腦缺血模型大鼠腦皮層Bcl-2、Bax表達水平比較 n=10，

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.01;與對照組比較，#P ＜0.01

Bcl-2/Bax假手術(shù)組組別 Bcl-2表達(%) Bax表達(%)32.0 ±2.1 12 ±1 2.65 ±0.05對照組 5.2 ±1.0* 60 ±2* 0.09 ±0.01*替勃龍組 33.1 ±2.2# 11 ±1# 3.00 ±0.10#

3 討論

有研究證實外源性雌激素可以明顯降低實驗性MCAO大鼠的病死率，減少腦梗死面積，證明外源性雌激素具有缺血性神經(jīng)保護作用［3］。據(jù)報道在大腦中動脈栓塞所致的局灶性腦缺血后，增加腦內(nèi)的Bcl-2的表達，可減少神經(jīng)細胞的凋亡，提示Bcl-2在缺血性腦損傷的病理發(fā)生中可能起內(nèi)源性保護作用。Bcl-2家族是目前研究較為深入的與凋亡密切相關(guān)的基因，它既能阻抑壞死又能阻抑凋亡［4］。研究證明，線粒體外膜通透性的改變可引起細胞凋亡，而這種通透性的改變直接由Bcl-2家族蛋白控制［5］。Bcl-2家族包含一組相關(guān)蛋白，根據(jù)其成員在細胞凋亡中的作用分為兩類:一類為抗凋亡蛋白，包括Bcl-2;另一類為促凋亡蛋白，包括Bax［6］。抗凋亡蛋白成員和促凋亡蛋白成員之間的協(xié)同作用共同決定細胞是否進入凋亡程序。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最重要的一對互相拮抗的凋亡相關(guān)因子，Bcl-2/Bax的比值在中樞神經(jīng)細胞凋亡中起關(guān)鍵作用，比值高，細胞存活率高;比值低，細胞存活率低。測定Bcl-2/Bax比值有利于判斷是否發(fā)生凋亡。以往研究顯示一過性局灶性腦缺血后促凋亡蛋白Bax表達明顯增加，且Bax陽性反應(yīng)位于 TUNEL陽性的細胞內(nèi)，其時程與空間的分布與TUNEL陽性神經(jīng)元一致［6］，提示Bax在介導(dǎo)缺血性神經(jīng)元損傷中起重要作用，這與本實驗研究結(jié)果相符合。本實驗觀察到替勃龍用藥組Bcl-2蛋白表達陽性細胞數(shù)不同程度增加，而Bax的蛋白陽性細胞數(shù)不同程度下降，Bcl-2/Bax比值增加，說明替勃龍可能通過上調(diào)Bcl-2/Bax比值而對腦缺血再灌注所造成的損傷起到一定的保護作用。

本實驗結(jié)果顯示替勃龍通過增強缺血再灌注后腦組織內(nèi)Bcl-2的表達，抑制Bax的表達，上調(diào)Bcl-2/Bax的比值，從而改善模型鼠缺血再灌注24 h后神經(jīng)功能缺損評分，減輕腦梗死體積和腦水腫，表明替勃龍對局灶腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

1 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversile middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rate.Stroke，1989，20:84-91.

2 Bederson JB，Pitts LH，TsujiM，et al.Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of the model and development of a neurologic examination.Stroke，1986，17:472-476.

3 Zhang YQ，Shi J，Rajakumar G，et al.Effects of gender and estradiol treatment on focal brain ischemia.Brain Res，1998，784:321-324.

4 Wei MC，Zong WX，Cheng EHY，et al.Proapoptotic BAX and BAK:a reguisite gateway to mitochondrial dysfunction and death.Science，2001，292:727-730.

5 Orrenius S.Mitochondrial regulation of apooptotic cell death.Toxicol Lett，2004，149:19-23.

6 Hsu SY，Hsueh AJ.Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis:An ovarian paradigm.Physiol Rev，2000，80:593-614.